干眼症患者的眼表微生物组

眼表是眼睛的第一道防线，因此它是感知外部威胁并消除潜在伤害的地方。 在进化过程中，各种微生物，尤其是细菌，已经作为共生体在眼表定居。 共生体具有维持眼表稳态的作用。 1 眼表先天免疫非常活跃，由抑制炎症的主动机制组成 2. 例如存在巨噬细胞、树突状细胞、抑制细胞、调节细胞、B细胞、IgA、溶菌酶、抗微生物肽和对外部代理的障碍。 眼表的正常共生体通过刺激眼表上皮细胞上的模式识别受体来维持基础水平的先天防御激活。 微生物的这种正常组成很重要，因为如果引入克服菌群的致病菌株，或者如果优势菌株分泌过度的免疫原性产物，例如引发边缘角膜炎的葡萄球菌外毒素 A，就会导致炎症和感染，一种形式IV 型超敏反应。 微生物组的菌群负荷也可能影响泪液功能，因为发现较高的菌群负荷与粘蛋白降解增加 3 和眼球细胞密度降低 4 有关。SERI/SNEC 之前的研究 [我不确定这些是哪些研究]指出微生物的重要性。 例如，在干眼症患者中，泪液中的溶血磷脂增加，这可能有助于炎症介质，如花生四烯酸和其他代谢物。 溶血磷脂由磷脂酶 A2 反应形成，后者可能来源于微生物。 由于干眼症是一种已知的眼表炎症性疾病，因此这是微生物促成病理的一种方式。

微生物组是在身体某个部位发现的微生物的总和。 在眼睛中，由于眼表的可及位置，微生物组可以非侵入性地进行研究。 尽管眼表微生物组很重要，但对该主题的理解非常肤浅，主要基于培养方法 5-10。 这可能会产生误导，因为一些微生物不太适合常规细胞培养，它们的存在可能未被检测到，或者它们的数量被低估了 11。 与培养物相比，最近开发的宏基因组测序有利于获得微生物组的无偏见观点 11。

之前的三项研究已经通过 16s rRNA 4、12 13 的宏基因组测序评估了眼表微生物组概况。 在患有干眼症或睑缘炎的受试者与健康受试者之间观察到微生物组的差异。 此外，与基于细菌培养的结果相比，发现了更多样的眼部菌群。

南洋理工大学化学与环境生命科学学院使用此类技术对微生物组进行了评估。 其基础是原核生物具有独特的 DNA 特征，通常可以表征起源物种，并且可以从检测到的不同 DNA 的相对丰度推断出不同物种的生物体的相对流行程度。 全球人类微生物组项目旨在了解人体不同部位的微生物组。 这在肠道中得到了最好的理解，但眼表的出版物尚未出现。

最近，我们的合作者发现 3 种细菌在眼睛的眼表中占主导地位。 它们是肺炎克雷伯菌、琼脂糖假单胞菌和鼠李糖乳杆菌。 这种 3 种细菌的优势是出乎意料的，因为眼表共生菌的主流观点是凝固酶阴性葡萄球菌占优势，其次是金黄色葡萄球菌和链球菌，革兰氏阴性菌较少，还有一些丙酸杆菌属 11。 在这 3 个物种中，肺炎克雷伯菌是一种已知的革兰氏阴性病原体，可引起感染性角膜炎，在某些情况下还会引起眼内炎。 假交替单胞菌和乳酸杆菌的作用完全未知。 前者是已知存在于海洋环境中的非致病性游离革兰氏阴性细菌。 令人惊讶的是，这 3 种主要细菌的高水平在 3 名人类参与者中相对恒定，这表明未患病个体的主要细菌微生物在眼表定植方面存在一定程度的均匀性。

可以通过结膜下穹窿的无菌交换，然后均质化和提取 DNA 来研究眼表微生物组。 细菌 DNA 的存在并不能告知微生物的功能，因为即使是死亡和未增殖的生物体也有残留的 DNA。 收集样本的技术也可以产生 RNA，并且通过逆转录 PCR，可以确定在眼表中发现的特定微生物转录物的存在。 此外，我们来自南洋理工学院的合作者开创了 MALDI TOF 质谱技术，该技术可以根据独特的细菌肽序列的鉴定来表征细菌蛋白质组。 总之，这些细菌转录物和蛋白质研究技术允许评估基因表达，并在某种程度上评估所发现细菌的功能状态。 对于以前未在眼表发现的微生物，这将非常重要。

除了明显的学术和科学进步外，该项目还具有医学意义和潜在的商业应用新知识产权。 首先，了解微生物组是治疗某些类型疾病（如边缘性角膜炎和异常感染性角膜炎）的第一步。 它表明了如何操纵免疫系统进行治疗。 其次，可以通过益生菌施用活微生物在眼表定殖来实现疾病和炎症的预防。 第三，这项研究可能会带来新的技术和检测方法，这些技术和检测方法可以识别微生物及其成分，这些成分可以开发成临床诊断检测方法。

我们有一些有兴趣与我们合作开发其中一些想法的行业合作者。

1. 目标

我们的目标是进行一项探索性研究，以：

1. 确定正常志愿者和干眼症患者眼表细菌微生物组的组成
2. 确定在人眼表面发现的细菌基因表达（细菌转录本）。
3. 表征可能与临床特征相关的微生物组的任何特征，例如年龄、泪膜状态、睑板腺功能障碍、暴露于环境刺激（如吸烟）等。

2. 预期风险和收益 预期风险 本研究预计不会出现任何潜在问题。 然而，从下结膜穹窿采集微生物组的过程中会有一些轻微的不适。 将给予患者非防腐剂丁卡因，以尽量减少任何不适。 我测试的 Schimers 期间也会有一些轻微的不适。

潜在的好处 随着对眼表各种微生物组存在的更深入了解，我们可以进一步了解正在发生的复杂过程。

3. 研究人群 3.1. 列出要注册的科目的数量和性质。 将从首席研究员服务的 SNEC 干眼诊所和综合诊所招募 90 名受试者。 将招募 45 名没有干眼症状的受试者作为正常对照，招募 45 名有干眼症状的受试者作为干眼受试者。

3.2. 招聘标准和招聘流程

1. 招募正常对照- 所有关于干眼症状的 8 个问题都必须在预筛选阶段清除干眼症状。 （附录 1）调查问卷根据 Schein et al.,1997 修改。 招募干眼受试者——8 个关于干眼症状的问题中至少有一个必须≥ 3 级
2. 受试者符合下面列出的所有纳入标准。
3. 清除排除标准。 在招募受试者之前，将征求主治医生的许可。 研究协调员将对符合条件的受试者进行研究咨询。 如果受试者感兴趣，研究协调员随后将陪同受试者进行 SERI 5 级的相关评估。 将从所有参与者那里获得知情的书面同意。

3.3.纳入标准

受试者必须满足所有纳入标准才能参与本研究。

1. 受试者必须年满 21 岁
2. 愿意进行本研究中的所有眼科检查

3.4.排除标准

所有在基线时满足任何排除标准的受试者将被排除在参与之外。

1. 已知的甲状腺疾病史（由医生诊断）。
2. 干燥综合征或类风湿性关节炎的已知病史（由医生诊断）。
3. 最近 3 个月内没有做过眼部手术，1 年内没有做过 LASIK 手术。
4. 眼表疾病如翼状胬肉，或明显的眼睑/眼眶疾病伴眼球突出。
5. 由临床研究者确定的任何其他特定原因。

4. 研究设计和程序/方法

学习规划：

观察性横断面研究

访问次数：

本研究将只有 1 次就诊。

学习时间：

1年

手续：

病史和干眼问卷的收集 会有一些问卷，包括病史和一套标准的干眼问卷，确定隐形眼镜使用、吸烟、职业等因素。

非侵入性撕裂时间 (OCULUS K5M) 非侵入性撕裂时间是使用 OCULUS K5M 以非侵入方式全自动测量的。 人眼看不到新的红外照明。 这可以防止在检查过程中出现眩光。 患者将舒适地坐在仪器前并自由眨眼，同时注视正前方的目标。 一旦参与者准备就绪，他们将被指示眨眼两次并避免眨眼。 Keratograph 5M 是全自动的，它会捕捉图像中的任何破损或变形，并记录破损时间。 每只眼睛将读取三个读数以获得平均值。

结膜发红 (OCULUS K5M) 将使用 OCULUS K5M 评估结膜发红。 患者将舒适地坐在仪器前，同时注视正前方的目标。 将捕获成像，并通过“JENVIS 分级量表”评估结膜发红的概览显示。 JENVIS 等级范围从 0 到 4。

发红值 定义 0 无发现，例如。 婴儿或婴儿

1. 单次注射，成人标准值
2. 轻度扩散注射
3. 严重的局部注射
4. 严重弥漫性注射

微生物组的收集将从双眼收集两个微生物组样本。 首先：将一滴无防腐剂的丁卡因滴入结膜穹窿。 刺痛感消失后，将使用无菌棉布轻轻滚动（最多 8 次）从下结膜穹窿收集微生物。 然后对另一只眼睛重复该过程。

然后将这些交换物浸泡在 DNA/RNA Shield (Zymo) 试剂中并立即匀浆 1 分钟，在 30 秒时停止，并在冰上保持 1 分钟，再匀浆 30 秒。 均质样品将储存在 4°C。 这确保了我们的目的的最佳和足够的 DNA/RNA 产量。 随后的核酸提取、PCR、测序和生物信息学程序将由我们的合作者执行。

贮存：拟在一年内分析，不超过5年。

角膜荧光素染色 (OCULUS K5M) 将一滴生理盐水滴在荧光素条 (Fluorets) 上，然后抖落至无可见液滴残留。 在将萤光引入右眼和左眼的下结膜穹窿之前，要求受试者抬头。 角膜荧光素染色将通过 Keratograph 5M 成像。 评分系统将基于 CCLRU。 简而言之，将有 5 个角膜区域。 染色比例为 0-4，每个区域有 0.5 个单位步长。 最后，将拍摄荧光素染色角膜的照片。

我测试的 Schirmers 这将使用 SERI 目前使用的标准试纸（5 毫米宽，带有折叠槽口）（Schirmer 撕裂试纸，Clement Clarke International，英国）完成。 不会使用预先麻醉剂。 条带将同时定位在双眼下眼睑边缘的下颞半部分。 研究参与者将被要求闭上眼睛。 任何过度的刺激迹象都会被注意到。 在测试 5 分钟后记录每个条带的润湿程度。 条带将被收集并储存在 1.5ml eppendorf 管中，在 -80˚C 下进行进一步分析。