Oculair oppervlaktemicrobioom bij patiënten met droge ogen

Het oogoppervlak is de eerste verdedigingslinie van het oog, het is daarom waar externe bedreigingen worden waargenomen en potentiële beledigingen worden geneutraliseerd. In de loop van de evolutie zijn verschillende microben, vooral bacteriën, het oogoppervlak gaan koloniseren als commensalen. De commensalen spelen een rol bij het handhaven van de homeostase van het oogoppervlak. 1 De aangeboren immuniteit van het oogoppervlak is zeer actief en bestaat uit actieve mechanismen om ontstekingen te onderdrukken 2. Er bestaan ​​bijvoorbeeld macrofagen, dendritische cellen, suppressorcellen, regulerende cellen, B-cellen, IgA, lysozym, antimicrobiële peptiden en barrières tegen externe agenten. De normale commensalen van het oogoppervlak handhaven een basaal activeringsniveau van de aangeboren afweer door de patroonherkenningsreceptoren op de epitheelcellen van het oogoppervlak te stimuleren. Deze normale samenstelling van microben is belangrijk omdat ontsteking en infectie het gevolg zullen zijn als er een pathogene stam wordt geïntroduceerd die de flora overwint, of als een dominante stam overmatig immunogene producten afscheidt, zoals het exotoxine A van Staphylococcus dat marginale keratitis veroorzaakt, een vorm van type IV overgevoeligheid. De flora-belasting van het microbioom zou ook de traanfunctie kunnen beïnvloeden, aangezien een hogere flora-belasting geassocieerd bleek te zijn met verhoogde mucine-afbraak 3 en verminderde globetceldichtheid 4. Eerdere studies [ik weet niet zeker welke studies dit zijn] bij SERI/SNEC ook wijzen op het belang van microben. Bij patiënten met droge ogen zijn er bijvoorbeeld verhoogde lysofosfolipiden in de traan, en dit kan bijdragen aan ontstekingsmediatoren zoals arachidonzuur en andere metabolieten. De lysofosfolipiden worden gevormd door fosfolipase A2-reacties, en de laatste kan van microbiële oorsprong zijn. Aangezien droge ogen een bekende ontstekingsziekte van het oogoppervlak is, is dit een manier waarop microben kunnen bijdragen aan de pathologie.

Het microbioom is de som van de microbe die op een lichaamslocatie wordt aangetroffen. In het oog kan het microbioom niet-invasief worden onderzocht vanwege de toegankelijke ligging van het oogoppervlak. Ondanks het belang van het microbioom van het oogoppervlak, is het begrip van dit onderwerp erg oppervlakkig en grotendeels gebaseerd op kweekmethoden5-10. Dit kan misleidend zijn omdat sommige microben niet zo vatbaar zijn voor routinematige celculturen en hun aanwezigheid mogelijk niet wordt opgemerkt of hun vertegenwoordiging wordt onderschat 11. Recent ontwikkelde metagenomics-sequencing, vergeleken met culturen, is voordelig om een ​​onbevooroordeeld beeld van het microbioom te krijgen.

Drie eerdere studies hebben de microbioomprofielen van het oogoppervlak geëvalueerd met metagenomics-sequencing van 16s rRNA 4, 12 13. Er werden verschillen in microbioom waargenomen tussen proefpersonen met droge ogen of blefaritis en gezonde proefpersonen. Bovendien werd een veel grotere diversiteit aan oculaire flora ontdekt in vergelijking met resultaten op basis van bacteriekweek.

De school voor chemische en ecologische levenswetenschappen aan de Nanyang Technological University heeft de microbiomen geëvalueerd met behulp van dergelijke technieken. De basis hiervan is dat prokaryote organismen unieke DNA-handtekeningen hebben die typisch de soort van oorsprong kunnen karakteriseren, en de relatieve prevalentie van de organismen van verschillende soorten kan worden afgeleid uit de relatieve overvloed van het verschillende gedetecteerde DNA. Het wereldwijde project voor het menselijk microbioom probeert het microbioom in verschillende delen van het menselijk lichaam te begrijpen. Dit wordt het best begrepen in de darm, maar publicaties over het oogoppervlak moeten nog verschijnen.

Onlangs hebben onze medewerkers ontdekt dat 3 bacteriën het oogoppervlak van het oog domineren. Dit zijn Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans en Lactobacillus rhamnosus. Deze dominantie van 3 soorten bacteriën was onverwacht, aangezien de dominante opvatting van commensalen van het oogoppervlak is dat coagulase-negatieve Staphylococcus domineert, gevolgd door Staphylococcus aureus en Streptococcus, met minder gram-negatieve bacteriën, en sommige Propionibacter spp 11. Van de 3 soorten is Klebsiella-pneumonie een bekende gramnegatieve ziekteverwekker die infectieuze keratitis en in sommige gevallen endoftalmitis kan veroorzaken. De rollen van Pseudoalteromonas en Lactobacillus zijn geheel onbekend. De eerste is een niet-pathogene vrij levende gram-negatieve bacterie waarvan bekend is dat deze aanwezig is in mariene omgevingen. Verrassend genoeg zijn de hoge niveaus van de 3 overheersende bacteriën relatief constant onder de 3 menselijke deelnemers, wat een zekere mate van uniformiteit suggereert in de kolonisatie van het oogoppervlak door belangrijke bacteriemicroben bij niet-zieke individuen.

Het microbioom van het oogoppervlak kan worden bestudeerd door steriel verwisselen van de onderste fornix van de conjunctiva, gevolgd door homogenisatie en extractie van DNA. De aanwezigheid van bacterie-DNA zegt niets over de functie van de microben, aangezien zelfs dode en niet-prolifererende organismen overgebleven DNA hebben. De techniek van het verzamelen van monsters kan ook RNA opleveren, en via reverse transcriptie-PCR is het mogelijk om de aanwezigheid van specifieke microbiële transcripten te bepalen die in het oogoppervlak worden aangetroffen. Bovendien hebben onze medewerkers van Nanyang Polytechnic pionierswerk verricht met MALDI TOF-massaspectrometrietechnieken die de karakterisering van bacteriële proteomen mogelijk maken, gebaseerd op identificatie van unieke bacteriële peptidesequenties. Samen maken deze technieken van bacterietranscript en eiwitonderzoek evaluatie mogelijk van de genexpressie en tot op zekere hoogte de functionele status van de ontdekte bacteriën. Dit zou buitengewoon belangrijk zijn in het geval van microben die nog niet eerder op het oogoppervlak zijn ontdekt.

Afgezien van de duidelijke academische en wetenschappelijke vooruitgang, heeft dit project ook medische implicaties en potentieel nieuw intellectueel eigendom voor commerciële toepassingen. Ten eerste is begrip van het microbioom de eerste stap om bepaalde soorten ziekten te behandelen, zoals marginale keratitis en ongebruikelijke infectieuze keratitis. Het suggereert hoe het immuunsysteem kan worden gemanipuleerd voor behandeling. Ten tweede kan preventie van ziekten en ontstekingen worden bereikt door probiotische toediening van levende microben om het oogoppervlak te koloniseren. Ten derde kan de studie leiden tot nieuwe technieken en assays die microben en hun componenten identificeren die kunnen worden ontwikkeld tot klinische diagnostische assays.

We hebben een aantal industriële medewerkers die geïnteresseerd zijn om met ons samen te werken om enkele van deze ideeën te ontwikkelen.

1. DOELSTELLINGEN

We willen een verkennend onderzoek uitvoeren om:

1. Bepaal de samenstelling van het bacteriële microbioom van het menselijke oogoppervlak bij normale vrijwilligers en patiënten met droge ogen
2. Bepaal de bacteriële genexpressie (bacteriële transcripties) gevonden in het menselijke oogoppervlak.
3. Karakteriseer elk kenmerk van het microbioom dat kan worden gekoppeld aan klinische kenmerken zoals leeftijd, status van de traanfilm, disfunctie van de Meibom-klier, blootstelling aan omgevingsstimulatie zoals roken, enz.

2. VERWACHTE RISICO'S EN VOORDELEN Verwachte risico's Er worden geen potentiële problemen verwacht voor deze studie. Er zal echter enig ongemak zijn tijdens het verzamelen van het microbioom uit de onderste conjunctivale fornix. Niet-conserverende tetracaïne zal aan de patiënt worden gegeven om enig ongemak te minimaliseren. Er zal ook enig licht ongemak zijn tijdens de Schimers I-test.

Potentiële voordelen Met een beter begrip van de aanwezigheid van verschillende microbioom in het oogoppervlak, kunnen we meer inzicht krijgen in het complexe proces dat plaatsvindt.

3. ONDERZOEKSBEVOLKING 3.1. Maak een lijst van het aantal en de aard van de vakken die moeten worden ingeschreven. Er zullen 90 proefpersonen worden gerekruteerd uit de SNEC-kliniek voor droge ogen en de algemene kliniek die wordt onderhouden door de hoofdonderzoeker. 45 proefpersonen zonder symptomen van droge ogen zullen worden aangeworven als normale controles en 45 proefpersonen met symptomatische droge ogen zullen worden aangeworven als proefpersonen met droge ogen.

3.2. Criteria voor werving en wervingsproces

1. Om normale controles te werven Alle 8 vragen over symptomen van droge ogen moeten vrij zijn van symptomen van droge ogen tijdens de pre-screeningsfase. (Bijlage 1) Vragenlijst aangepast naar Schein et al., 1997. Om proefpersonen met droge ogen te rekruteren - Ten minste één van de 8 vragen over symptomen van droge ogen moet ≥ graad 3 zijn
2. Onderwerpen voldoen aan alle onderstaande inclusiecriteria.
3. Vrij van uitsluitingscriteria. Voordat proefpersonen worden geworven, wordt toestemming gevraagd aan de behandelende artsen. In aanmerking komende vakken krijgen studiebegeleiding door de studiecoördinator. Als het onderwerp geïnteresseerd is, begeleidt de studiecoördinator het vak vervolgens naar SERI-niveau 5 voor de relevante beoordelingen. Geïnformeerde schriftelijke toestemming zal worden verkregen van alle deelnemers.

3.3. Inclusiecriteria

De proefpersoon moet aan alle inclusiecriteria voldoen om aan dit onderzoek deel te nemen.

1. Onderwerpen moeten 21 jaar of ouder zijn
2. Bereid om alle oogonderzoeken in deze studie uit te voeren

3.4. Uitsluitingscriteria

Alle proefpersonen die bij aanvang aan een van de uitsluitingscriteria voldoen, worden uitgesloten van deelname.

1. Bekende geschiedenis van schildklieraandoeningen (gediagnosticeerd door arts).
2. Bekende geschiedenis van het syndroom van Sjögren of reumatoïde artritis (gediagnosticeerd door een arts).
3. Geen oogchirurgie in de afgelopen 3 maanden en LASIK binnen 1 jaar.
4. Oculaire oppervlakteziekten zoals pterygium, of duidelijke ooglid- / oogkasziekte met lagophthalmus.
5. Elke andere gespecificeerde reden zoals vastgesteld door de klinische onderzoeker.

4. ONDERZOEKSOPZET EN PROCEDURES/METHODOLOGIE

Studie opzet:

Observationeel - Cross-sectioneel onderzoek

Aantal bezoeken:

Er zal slechts 1 bezoek zijn in deze studie.

Studieduur:

1 jaar

Procedures:

Verzameling van medische geschiedenis en vragenlijst voor droge ogen Er zal een vragenlijst zijn die bestaat uit de medische geschiedenis en een standaardset vragenlijsten voor droge ogen die factoren identificeren zoals gebruik van contactlenzen, roken, beroep enz.

Niet-invasieve traanafbreektijd (OCULUS K5M) De niet-invasieve traanafbreektijd wordt niet-invasief en volledig automatisch gemeten met behulp van OCULUS K5M. De nieuwe infraroodverlichting is niet zichtbaar voor het menselijk oog. Dit voorkomt verblinding tijdens het onderzoek. De patiënt zit comfortabel voor het instrument en knippert vrijelijk terwijl hij zich op een doel direct voor hem fixeert. Zodra de deelnemer klaar is, krijgt hij de instructie om twee keer te knipperen en niet te knipperen. Keratograph 5M is volledig geautomatiseerd en legt elke onderbreking of vervorming in het beeld vast en het tijdstip van de onderbreking wordt genoteerd. Voor elk oog worden drie metingen uitgevoerd om de gemiddelde waarde te krijgen.

Conjunctiva roodheid (OCULUS K5M) Conjunctiva roodheid wordt beoordeeld met behulp van OCULUS K5M. De patiënt zal comfortabel voor het instrument zitten terwijl hij zich op een doel direct voor hem fixeert. De afbeelding wordt vastgelegd en een overzichtsweergave van de roodheid van het bindvlies wordt geëvalueerd door "JENVIS Grading Scale". JENVIS-schaalbereik van 0 tot 4.

Roodheidswaarde Definitie 0 Geen bevindingen, bijv. Baby's of kleuters

1. Enkelvoudige injecties, standaardwaarde voor volwassenen
2. Milde diffuse injecties
3. Ernstige lokale injecties
4. Ernstige diffuse injecties

Verzameling van het microbioom Er worden twee exemplaren van het microbioom uit beide ogen verzameld. Ten eerste: een druppel niet-geconserveerde tetracaïne wordt in de conjunctivale fornix gedruppeld. Nadat het prikkende gevoel is verdwenen, wordt een steriel wattenstaafje gebruikt om de microben uit de onderste conjunctivale fornix te verzamelen met een zachte rollende beweging (tot 8 slagen). De procedure wordt vervolgens herhaald voor het andere oog.

Deze swaps worden vervolgens gedrenkt in DNA/RNA Shield (Zymo)-reagens en onmiddellijk gedurende 1 minuut gehomogeniseerd, na 30 seconden gestopt en 1 minuut op ijs gehouden en nog eens 30 seconden gehomogeniseerd. Gehomogeniseerde monsters worden bewaard bij 4°C. Dit zorgt voor een optimale en voldoende DNA/RNA-opbrengst voor ons doel. Daaropvolgende nucleïnezuurextractie, PCR, sequencing en bioinformatica-procedures zullen worden uitgevoerd door onze medewerkers.

Opslag: bedoeld voor analyse binnen een jaar, niet langer dan 5 jaar.

Hoornvliesfluoresceïnekleuring (OCULUS K5M) Een druppel normale zoutoplossing wordt op de fluoresceïnestrip (Fluorets) gedruppeld en vervolgens afgeschud zodat er geen zichtbare druppel overblijft. De proefpersoon wordt gevraagd om op te kijken voordat de fluor wordt geïntroduceerd in de inferieure conjunctivale fornix aan het rechter- en vervolgens aan het linkeroog. Hoornvliesfluoresceïnekleuring wordt afgebeeld door Keratograph 5M. Het scoresysteem is gebaseerd op CCLRU. In het kort zullen er 5 hoornvlieszones zijn. De kleuringsschaal is 0-4, met stappen van 0,5 eenheid in elk van de zones. Als laatste wordt er een foto gemaakt van het met fluoresceïne gekleurde hoornvlies.

Schirmers I-test Dit wordt gedaan met de standaardstrips die momenteel bij SERI worden gebruikt (5 mm breed met een inkeping om te vouwen) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, VK). Er wordt geen voorafgaande verdoving gebruikt. De strips worden tegelijkertijd in beide ogen over de inferieure temporale helft van de onderste ooglidrand geplaatst. De studiedeelnemer wordt gevraagd de ogen te sluiten. Eventuele tekenen van overmatige irritatie worden opgemerkt. De mate van bevochtiging in elke strip wordt geregistreerd na 5 minuten testen. De strip wordt verzameld en bewaard in eppendorfbuisjes van 1,5 ml bij -80 °C tot verdere analyse.