Silmän pinnan mikrobiomi kuivasilmäpotilailla

Silmän pinta on silmän ensimmäinen puolustuslinja, joten se on paikka, jossa ulkoiset uhat havaitaan ja mahdolliset loukkaukset neutraloidaan. Evoluution aikana erilaiset mikrobit, erityisesti bakteerit, ovat tulleet kolonisoimaan silmän pintaa kommensaaleina. Kommensaalien tehtävänä on ylläpitää silmän pinnan homeostaasia. 1 Silmän pinnan luontainen immuniteetti on erittäin aktiivinen ja koostuu aktiivisista tulehduksen tukahduttamismekanismeista. 2. On esimerkiksi makrofageja, dendriittisoluja, suppressorisoluja, säätelysoluja, B-soluja, IgA:ta, lysotsyymiä, antimikrobisia peptidejä ja esteitä ulkoisia tekijöitä vastaan. Silmän pinnan normaalit kommensaalit ylläpitävät luontaisen puolustuksen aktivaation perustasoa stimuloimalla muodontunnistusreseptoreita silmän pinnan epiteelisoluissa. Tämä normaali mikrobikoostumus on tärkeä, koska seurauksena on tulehdus ja infektio, jos patogeeninen kanta, joka voittaa kasviston, tai jos hallitseva kanta erittää liikaa immunogeenisiä tuotteita, kuten Staphylococcus-eksotoksiini A, joka laukaisee marginaalisen keratiitin. tyypin IV yliherkkyys. Mikrobiomin kasvisto voi myös vaikuttaa kyynelten toimintaan, sillä korkeamman kasvistokuorman havaittiin liittyvän lisääntyneeseen musiinin hajoamiseen 3 ja alentuneeseen maapallon solutiheyteen 4. Myös aiemmat tutkimukset [en ole varma, mitä tutkimuksia nämä ovat] SERI/SNEC:ssä huomauttaa mikrobien tärkeydestä. Esimerkiksi kuivasilmäisillä potilailla kyynelnesteen lysofosfolipidit ovat lisääntyneet, ja tämä voi myötävaikuttaa tulehduksen välittäjiin, kuten arakidonihappoon ja muihin metaboliitteihin. Lysofosfolipidit muodostuvat fosfolipaasi A2-reaktioista, ja jälkimmäinen voi olla mikrobiperäistä. Koska kuivasilmä on tunnettu silmän pinnan tulehduksellinen sairaus, tämä on yksi tapa, jolla mikrobit voivat myötävaikuttaa patologiaan.

Mikrobiomi on kehon sijainnista löytyneiden mikrobien kokonaismäärä. Silmässä mikrobiomia voidaan tutkia ei-invasiivisesti silmän pinnan saavutettavissa olevan sijainnin vuoksi. Silmän pinnan mikrobiomin merkityksestä huolimatta tämän aiheen ymmärtäminen on hyvin pinnallista ja perustuu suurelta osin viljelymenetelmiin5-10. Tämä voi olla harhaanjohtavaa, koska jotkin mikrobit eivät ole niin alttiita rutiininomaisille soluviljelmille ja niiden läsnäolo voi jäädä havaitsematta tai niiden edustus aliarvioitu 11. Äskettäin kehitetty metagenominen sekvensointi on viljelmiin verrattuna edullinen, jotta saadaan puolueeton näkemys mikrobiomista11.

Kolmessa aikaisemmassa tutkimuksessa on arvioitu silmän pinnan mikrobiomiprofiileja 16s rRNA:n 4, 12 13 metagenomisella sekvensoinnilla. Erot mikrobiomissa havaittiin koehenkilöiden, joilla oli kuivasilmäisyys tai blefariitti, ja terveiden koehenkilöiden välillä. Lisäksi havaittiin paljon suurempi silmän kasviston monimuotoisuus verrattuna bakteeriviljelmään perustuviin tuloksiin.

Nanyangin teknillisen yliopiston kemian ja ympäristön biotieteiden koulu on arvioinut mikrobiomit tällaisilla tekniikoilla. Tämän perustana on, että prokaryoottisilla organismeilla on ainutlaatuiset DNA-tunnisteet, jotka voivat tyypillisesti karakterisoida alkuperälajin, ja eri lajien organismien suhteellinen esiintyvyys voidaan päätellä havaitun eri DNA:n suhteellisesta runsaudesta. Globaali ihmisen mikrobiomiprojekti pyrkii ymmärtämään mikrobiomia ihmiskehon eri osissa. Tämä ymmärretään parhaiten suolistossa, mutta silmän pintaa koskevia julkaisuja ei ole vielä syntynyt.

Äskettäin yhteistyökumppanimme on havaittu, että silmän silmän pintaa hallitsi 3 bakteeria. Näitä ovat Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans ja Lactobacillus rhamnosus. Tämä kolmen bakteerityypin dominanssi oli odottamaton, koska hallitseva näkemys silmän pinnan kommensaaleista on, että koagulaasinegatiivinen Staphylococcus hallitsee, jota seuraavat Staphylococcus aureus ja Streptococcus, joissa on vähemmän gramnegatiivisia bakteereja, ja jotkut Propionibacter spp 11. Kolmesta lajista Klebsiella-keuhkokuume on tunnettu gramnegatiivinen patogeeni, joka voi aiheuttaa tarttuvaa keratiittia ja joissakin tapauksissa endoftalmiittia. Pseudoalteromonasin ja Lactobacilluksen roolit ovat täysin tuntemattomia. Edellinen on ei-patogeeninen vapaa elävä gramnegatiivinen bakteeri, jonka tiedetään esiintyvän meriympäristössä. Yllättäen kolmen hallitsevan bakteerin korkeat tasot ovat suhteellisen vakioita kolmen ihmisen joukossa, mikä viittaa tiettyyn tasaisuuteen tärkeimpien bakteerimikrobien kolonisaatiossa silmän pinnalla ei-sairailla yksilöillä.

Silmän pinnan mikrobiomia voidaan tutkia vaihtamalla sidekalvon alemman fornixin steriili vaihto, minkä jälkeen homogenisoidaan ja uuttaa DNA. Bakteeri-DNA:n läsnäolo ei kerro mikrobien toiminnasta, sillä jopa kuolleissa ja lisääntymättömissä organismeissa on jäännös-DNA:ta. Näytteiden keräystekniikka voi myös tuottaa RNA:ta, ja käänteistranskriptio-PCR:stä on mahdollista määrittää spesifisten mikrobitranskriptien läsnäolo, joita löytyy silmän pinnasta. Lisäksi yhteistyökumppanimme Nanyang Polytechnicistä ovat kehittäneet MALDI TOF -massaspektrometriatekniikoita, jotka mahdollistavat bakteeriproteomien karakterisoinnin ainutlaatuisten bakteeripeptidisekvenssien tunnistamisen perusteella. Yhdessä nämä bakteerien transkripti- ja proteiinitutkimustekniikat mahdollistavat löydettyjen bakteerien geeniekspression ja jossain määrin arvioinnin. Tämä olisi erittäin tärkeää sellaisten mikrobien tapauksessa, joita ei ole aiemmin löydetty silmän pinnalta.

Ilmeisen akateemisen ja tieteellisen edistyksen lisäksi tällä hankkeella on myös lääketieteellisiä vaikutuksia ja mahdollista uutta immateriaaliomaisuutta kaupallisiin sovelluksiin. Ensinnäkin mikrobiomin ymmärtäminen on ensimmäinen askel tietyntyyppisten sairauksien, kuten marginaalisen keratiitin ja epätavallisen tarttuvan keratiitin, hoidossa. Se ehdottaa, kuinka immuunijärjestelmää voidaan manipuloida hoitoa varten. Toiseksi sairauksien ja tulehdusten ehkäisy voidaan saavuttaa antamalla probioottisia eläviä mikrobeja kolonisoimaan silmän pintaa. Kolmanneksi tutkimus voi johtaa uusiin tekniikoihin ja määrityksiin, joilla tunnistetaan mikrobit ja niiden komponentit, joita voidaan kehittää kliinisiksi diagnostisiksi määrityksiksi.

Meillä on alan yhteistyökumppaneita, jotka ovat kiinnostuneita kumppaniksemme kehittämään joitain näistä ideoista.

1. TAVOITTEET

Tavoitteenamme on tehdä esiselvittävä tutkimus:

1. Selvitä ihmisen silmäpinnan bakteeri-mikrobiomin koostumus normaaleilla vapaaehtoisilla ja kuivasilmäpotilailla
2. Määritä ihmisen silmän pinnasta löytyvä bakteerigeenin ilmentyminen (bakteeritranskriptit).
3. Kuvaile mitä tahansa mikrobiomin piirteitä, jotka voivat liittyä kliinisiin ominaisuuksiin, kuten ikään, kyynelkalvon tilaan, Meibomin rauhasten toimintahäiriöön, altistumiseen ympäristön stimulaatioille, kuten tupakoinnille, jne.

2. ODOTETUT RISKIT JA EDUT Odotetut riskit Tässä tutkimuksessa ei ole odotettavissa ongelmia. Pientä epämukavuutta esiintyy kuitenkin mikrobiomin keräämisen aikana sidekalvon alemmasta fornixista. Potilaalle annetaan säilöntäaineetonta tetrakaiinia epämukavuuden minimoimiseksi. Schimers I -testin aikana tulee myös hieman epämukavuutta.

Mahdolliset hyödyt Kun ymmärrämme paremmin erilaisten mikrobiomien läsnäoloa silmän pinnalla, voimme saada lisätietoa tapahtuvasta monimutkaisesta prosessista.

3. OPINTOJEN VÄESTÖ 3.1. Ilmoita ilmoittautuvien aiheiden lukumäärä ja luonne. 90 koehenkilöä rekrytoidaan SNEC:n kuivasilmäiseltä klinikalta ja päätutkijan hoitamalta yleisklinikalta. 45 koehenkilöä, joilla ei ole kuivasilmäisyyden oireita, rekrytoidaan normaaleiksi kontrolleiksi ja 45 koehenkilöä, joilla on oireinen kuivasilmäisyys, rekrytoidaan kuivasilmäisiksi.

3.2. Rekrytointikriteerit ja rekrytointiprosessi

1. Normaalien kontrollien värvääminen - Kaikissa 8 kuivasilmäisyyden oireita koskevissa kysymyksissä on oltava kuivasilmäisyyden oireita esiseulontavaiheen aikana. (Liite 1) Kyselylomake muokattu Schein et al., 1997 mukaan. Kuivan silmän koehenkilöiden värvääminen - vähintään yhden kahdeksasta kuivasilmäisyyden oireita koskevasta kysymyksestä on oltava ≥ luokka 3
2. Koehenkilöt täyttävät kaikki alla luetellut osallistumiskriteerit.
3. Ei sisällä poissulkemiskriteereitä. Lupa pyydettäisiin hoitavilta lääkäreiltä ennen koehenkilöiden rekrytointia. Tukikelpoisia aineita neuvoo opinnoissa opintokoordinaattori. Jos aihe kiinnostaa, opintokoordinaattori seuraa oppiaineen SERI-tasolle 5 asiaankuuluvia arviointeja varten. Kaikilta osallistujilta hankitaan tietoinen kirjallinen suostumus.

3.3. Sisällyttämiskriteerit

Tutkittavan on täytettävä kaikki osallistumiskriteerit voidakseen osallistua tähän tutkimukseen.

1. Tutkittavien tulee olla vähintään 21-vuotiaita
2. Haluan suorittaa kaikki silmätutkimukset tässä tutkimuksessa

3.4. Poissulkemiskriteerit

Kaikki tutkittavat, jotka täyttävät lähtötilanteessa jonkin poissulkemiskriteerin, suljetaan pois osallistumisesta.

1. Tunnettu kilpirauhasen toimintahäiriö (lääkärin diagnosoima).
2. Tunnettu Sjogrenin oireyhtymä tai nivelreuma (lääkärin diagnosoima).
3. Ei silmäleikkausta viimeisen 3 kuukauden aikana ja LASIK 1 vuoden sisällä.
4. Silmän pintasairaudet, kuten pterygium tai ilmeinen silmäluomeen/orbitaalisairaus, johon liittyy lagoftalmos.
5. Mikä tahansa muu kliinisen tutkijan määrittelemä syy.

4. TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU JA MENETELMÄT/MENETELMÄT

Opintojen suunnittelu:

Havainnointi - Poikkileikkaustutkimus

Käyntien määrä:

Tässä tutkimuksessa on vain yksi käynti.

Opintojen kesto:

1 vuosi

Toimenpiteet:

Lääketieteellisen historian ja kuivasilmäkyselylomakkeen kokoelma Tulee olemaan kyselylomake, joka koostuu sairaushistoriasta ja vakiokokoisista kuivasilmäisistä kyselylomakkeista, jotka tunnistavat tekijät, kuten piilolinssien käytön, tupakoinnin, ammatin ja niin edelleen.

Ei-invasiivinen kyynelten hajoamisaika (OCULUS K5M) Ei-invasiivinen kyynelten hajoamisaika mitataan ei-invasiivisesti ja täysin automaattisesti OCULUS K5M:llä. Uusi infrapunavalo ei näy ihmissilmälle. Tämä estää häikäisyä tutkimuksen aikana. Potilas istuu mukavasti instrumentin edessä ja räpäyttää vapaasti kiinnittyessään suoraan edessä olevaan kohteeseen. Kun osallistuja on valmis, häntä kehotetaan räpäyttämään kaksi kertaa ja pidättäytymään räpäyttämästä. Keratograph 5M on täysin automatisoitu ja se tallentaa kuvan mahdolliset katkokset tai vääristymät, ja katkon aika merkitään muistiin. Jokaisesta silmästä otetaan kolme lukemaa keskiarvon saamiseksi.

Sidekalvon punoitus (OCULUS K5M) Sidekalvon punoitus arvioidaan OCULUS K5M:llä. Potilas istuu mukavasti instrumentin edessä ja kiinnittyy suoraan edessä olevaan kohteeseen. Kuva otetaan ja sidekalvon punoituksen yleisnäkymä arvioidaan "JENVIS Grading Scale" -asteikolla. JENVIS-asteikkoalue 0-4.

Punoitusarvo Määritelmä 0 Ei löydöksiä, esim. Vauvoja tai vauvoja

1. Yksittäiset injektiot, vakioarvo aikuisille
2. Lievät hajainjektiot
3. Vaikeat paikalliset injektiot
4. Vaikeat hajainjektiot

Mikrobiomin kerääminen Molemmista silmistä otetaan kaksi mikrobiominäytettä. Ensinnäkin: pisara säilöntämätöntä tetrakaiinia tiputetaan sidekalvoon. Kun pistely on hävinnyt, steriilillä vanupuikolla kerätään mikrobit alemmasta sidekalvosta kevyesti pyörittämällä (jopa 8 vetoa). Toimenpide toistetaan sitten vastakkaiselle silmälle.

Nämä swapit liotetaan sitten DNA/RNA Shield (Zymo) -reagenssissa ja homogenoidaan välittömästi 1 minuutin ajan, lopetetaan 30 sekunnin kohdalla ja pidetään jäissä 1 minuutin ajan ja homogenoidaan vielä 30 sekuntia. Homogenisoidut näytteet säilytetään 4 °C:ssa. Tämä takaa optimaalisen ja riittävän DNA/RNA-saannon tarkoitukseemme. Yhteistyökumppanimme suorittavat myöhemmät nukleiinihapon uutto-, PCR-, sekvensointi- ja bioinformatiikan toimenpiteet.

Varastointi: tarkoitettu analysoitavaksi vuoden sisällä, enintään 5 vuotta.

Sarveiskalvon fluoreseiinivärjäys (OCULUS K5M) Fluoreseiiniliuskaan (Fluorets) tiputetaan tippa normaalia suolaliuosta, jonka jälkeen se ravistetaan pois niin, ettei siihen jää näkyvää pisaraa. Koehenkilöä pyydetään katsomaan ylös ennen fluoretin lisäämistä oikean ja sitten vasemman silmän alempaan sidekalvoon. Sarveiskalvon fluoreseiinivärjäys kuvataan Keratograph 5M:llä. Pisteytysjärjestelmä perustuu CCLRU:han. Lyhyesti sanottuna sarveiskalvovyöhykkeitä on 5. Värjäysasteikko on 0-4, 0,5 yksikköaskel jokaisella vyöhykkeellä. Lopuksi otetaan kuva fluoreseiinivärjätystä sarveiskalvosta.

Schirmers I -testi Tämä tehdään SERI:ssä tällä hetkellä käytössä olevilla vakionauhoilla (5 mm leveä lovi taittumista varten) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Aikaisempaa anestesiaa ei käytetä. Nauhat sijoitetaan alaluomeen alemman temporaalisen puoliskon päälle molemmissa silmissä samanaikaisesti. Tutkimukseen osallistujaa pyydetään sulkemaan silmänsä. Kaikki liialliset ärsytysmerkit huomioidaan. Jokaisen liuskan kostutuksen määrä kirjataan 5 minuutin testauksen jälkeen. Liuska kerätään ja säilytetään 1,5 ml:n eppendorf-putkissa -80 °C:ssa lisäanalyysiin asti.