Øyeoverflatemikrobiom hos pasienter med tørre øyne

Den okulære overflaten er øyets første forsvarslinje, det er derfor der ytre trusler sanses og potensielle fornærmelser nøytraliseres. I løpet av evolusjonen har forskjellige mikrober, spesielt bakterier, kolonisert øyeoverflaten som kommensaler. Kommensalene har en rolle for å opprettholde homeostasen til den okulære overflaten. 1 Den medfødte immuniteten til øyeoverflaten er svært aktiv, og består av aktive mekanismer for å undertrykke betennelse 2. Det finnes for eksempel makrofager, dendrittiske celler, suppressorceller, regulatoriske celler, B-celler, IgA, lysozym, antimikrobielle peptider og barrierer mot eksterne agenter. De normale kommensalene til den okulære overflaten opprettholder et basalt nivå av aktivering av medfødt forsvar ved å stimulere mønstergjenkjenningsreseptorene på okulære overflateepitelceller. Denne normale sammensetningen av mikrober er viktig siden betennelse og infeksjon vil oppstå hvis det er introduksjon av en patogen stamme som overvinner floraen, eller hvis en dominerende stamme skiller ut for immunogene produkter, som eksotoksin A fra Staphylococcus som utløser marginal keratitt, en form av type IV overfølsomhet. Florabelastningen til mikrobiom kan også påvirke tårefunksjonen ettersom en høyere florabelastning ble funnet å være assosiert med økt mucinnedbrytning 3 og redusert globetcelletetthet 4. Tidligere studier [Jeg er ikke sikker på hvilke studier dette er] ved SERI/SNEC også peke på viktigheten av mikrober. For eksempel hos pasienter med tørre øyne er det økte lysofosfolipider i tåren, og dette kan bidra til inflammatoriske mediatorer som arakidonsyre og andre metabolitter. Lysofosfolipidene dannes ved fosfolipase A2-reaksjoner, og sistnevnte kan ha mikrobiell opprinnelse. Siden tørre øyne er en kjent betennelsessykdom i øyets overflate, er dette en måte mikrober kan bidra til patologien.

Mikrobiomet er summen av mikroben som finnes på et kroppssted. I øyet kan mikrobiomet undersøkes ikke-invasivt på grunn av den tilgjengelige plasseringen av den okulære overflaten. Til tross for viktigheten av det okulære overflatemikrobiomet, er forståelsen av dette emnet svært overfladisk og i stor grad basert på kulturmetoder5-10. Dette kan være misvisende fordi noen av mikrobene ikke er så mottagelige for rutinemessige cellekulturer og deres tilstedeværelse kan være uoppdaget eller deres representasjon undervurdert 11. Nylig utviklet metagenomikk-sekvensering, sammenlignet med kulturer, er fordelaktig for å få et upartisk syn på mikrobiom11.

Tre tidligere studier har evaluert mikrobiomprofilene til den okulære overflaten med metagenomisk sekvensering av 16s rRNA 4, 12 13. Forskjeller i mikrobiom ble observert mellom personer med tørre øyne eller blefaritt, og friske personer. Dessuten ble det oppdaget et mye større mangfold av øyeflora sammenlignet med resultater basert på bakteriekultur.

Skolen for kjemisk og miljømessig livsvitenskap ved Nanyang Technological University har evaluert mikrobiomene ved å bruke slike teknikker. Grunnlaget for dette er at prokaryote organismer har unike DNA-signaturer som typisk kan karakterisere opprinnelsesarten, og den relative utbredelsen av organismene til forskjellige arter kan utledes fra den relative overfloden av det forskjellige DNA som er påvist. Det globale menneskelige mikrobiomprosjektet søker å forstå mikrobiomet i forskjellige deler av menneskekroppen. Dette er best forstått i tarmen, men publikasjoner om den okulære overflaten har ennå ikke dukket opp.

Nylig har våre samarbeidspartnere blitt funnet at 3 bakterier dominerte den okulære overflaten av øyet. Disse er Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans og Lactobacillus rhamnosus. Denne dominansen av 3 typer bakterier var uventet, siden det dominerende synet på okulære overflatekommensaler er at koagulase-negative Staphylococcus dominerer, etterfulgt av Staphylococcus aureus og Streptococcus, med færre gramnegative bakterier, og noen Propionibacter spp 11. Blant de 3 artene er Klebsiella pneumoni et kjent gramnegativt patogen som kan forårsake infeksiøs keratitt, og i noen tilfeller endoftalmitt. Rollene til Pseudoalteromonas og Lactobacillus er helt ukjente. Førstnevnte er en ikke-patogen fri levende gramnegativ bakterie som er kjent for å være tilstede i marine omgivelser. Overraskende nok er de høye nivåene av de 3 dominerende bakteriene relativt konstante blant de 3 menneskelige deltakerne, noe som tyder på en viss enhetlighet i koloniseringen av øyeoverflaten av store bakteriemikrober hos ikke-syke individer.

Det okulære overflatemikrobiomet kan studeres ved sterilt bytte av den nedre fornix av konjunktiva etterfulgt av homogenisering og ekstraksjon av DNA. Tilstedeværelsen av bakterie-DNA informerer ikke om funksjonen til mikrobene, siden selv døde og ikke-prolifererende organismer har gjenværende DNA. Teknikken med å samle prøver kan også gi RNA, og fra revers transkripsjons-PCR er det mulig å bestemme tilstedeværelsen av spesifikke mikrobielle transkripsjoner som finnes i den okulære overflaten. Videre har våre samarbeidspartnere fra Nanyang Polytechnic vært banebrytende med MALDI TOF massespektrometriteknikker som tillater karakterisering av bakterieproteomer, basert på identifikasjon av unike bakterielle peptidsekvenser. Sammen tillater disse teknikkene for bakterietranskript og proteinundersøkelser evaluering av genuttrykket og til en viss grad funksjonell status til bakteriene som er oppdaget. Dette vil være ekstremt viktig når det gjelder mikrober som ikke tidligere er oppdaget på den okulære overflaten.

Bortsett fra det åpenbare akademiske og vitenskapelige fremskrittet, har dette prosjektet også medisinske implikasjoner og potensiell ny intellektuell eiendom for kommersielle applikasjoner. For det første er forståelse av mikrobiomet det første trinnet for å behandle visse typer sykdommer som marginal keratitt og uvanlig smittsom keratitt. Det antyder hvordan immunsystemet kan manipuleres for behandling. For det andre kan forebygging av sykdommer og betennelser oppnås ved probiotisk administrering av levende mikrober for å kolonisere den okulære overflaten. For det tredje kan studien føre til nye teknikker og analyser som identifiserer mikrober og deres komponenter som kan utvikles til kliniske diagnostiske analyser.

Vi har noen industrisamarbeidspartnere som er interessert i å samarbeide med oss ​​for å utvikle noen av disse ideene.

1. MÅL

Vi tar sikte på å gjennomføre en utforskende studie for å:

1. Bestem sammensetningen av bakteriemikrobiomet til den menneskelige øyeoverflaten hos normale frivillige og pasienter med tørre øyne
2. Bestem det bakterielle genuttrykket (bakterielle transkripsjonene) som finnes i den menneskelige okulære overflaten.
3. Karakteriser ethvert trekk ved mikrobiomet som kan være knyttet til kliniske egenskaper som alder, status for tårefilm, dysfunksjon av Meibomian kjertel, eksponering for miljøstimulering som røyking, etc.

2. FORVENTEDE RISIKO OG FORDELER Forventede risikoer Det forventes ingen potensielle problemer for denne studien. Imidlertid vil det være noe ubehag under innsamling av mikrobiom fra den nedre konjunktivale fornix. Ikke-konserverende tetrakain vil bli gitt til pasienten for å minimere ubehag. Det vil også være noe ubehag under Schimers I-testen.

Potensielle fordeler Med større forståelse for tilstedeværelsen av ulike mikrobiomer i øyeoverflaten, kan vi få ytterligere innsikt i den komplekse prosessen som foregår.

3. STUDIEBEFOLKNING 3.1. Oppgi antall og art av fag som skal meldes på. 90 forsøkspersoner vil bli rekruttert fra SNEC tørrøyeklinikk og generell klinikk som betjenes av hovedetterforskeren. 45 forsøkspersoner uten symptomer på tørre øyne vil bli rekruttert som normale kontroller og 45 forsøkspersoner med symptomatisk tørre øyne vil bli rekruttert som forsøkspersoner med tørre øyne.

3.2. Kriterier for rekruttering og rekrutteringsprosess

1. For å rekruttere normale kontroller- Alle de 8 spørsmålene om symptomer på tørre øyne må være fri for symptomer på tørre øyne under pre-screeningsstadiet. (Vedlegg 1) Spørreskjema modifisert etter Schein et al.,1997. For å rekruttere tørre øyne - Minst ett av de 8 spørsmålene om symptomer på tørre øyne må være ≥ grad 3
2. Emner oppfyller alle inklusjonskriteriene nedenfor.
3. Klar for eksklusjonskriterier. Tillatelse vil bli søkt fra de behandlende legene før forsøkspersoner rekrutteres. Kvalifiserte emner vil bli veiledet om studiet av studiekoordinator. Dersom faget er interessert, vil studiekoordinator da følge faget til SERI nivå 5 for de aktuelle vurderingene. Informert skriftlig samtykke vil bli innhentet fra alle deltakere.

3.3. Inklusjonskriterier

Forsøkspersonen må oppfylle alle inklusjonskriteriene for å delta i denne studien.

1. Fagene må være 21 år eller eldre
2. Villig til å utføre alle øyeundersøkelsene i denne studien

3.4. Eksklusjonskriterier

Alle forsøkspersoner som oppfyller noen av eksklusjonskriteriene ved baseline vil bli ekskludert fra deltakelse.

1. Kjent historie med skjoldbrusksykdommer (diagnostisert av lege).
2. Kjent historie med Sjøgrens syndrom eller revmatoid artritt (diagnostisert av lege).
3. Ingen øyekirurgi de siste 3 månedene og LASIK innen 1 år.
4. Okulære overflatesykdommer som pterygium, eller åpenbar lokk/orbital sykdom med lagoftalmos.
5. Enhver annen spesifisert årsak som bestemt av klinisk etterforsker.

4. STUDIEDESIGN OG PROSEDYRER/METODOLOGI

Studere design:

Observasjons-Tverrsnittsstudie

Antall besøk:

Det vil kun være 1 besøk i denne studien.

Varighet av studiet:

1 år

Prosedyrer:

Innsamling av medisinsk historie og tørre øyne spørreskjema Det vil være et spørreskjema som består av sykehistorie og et standard sett med tørre øyne spørreskjemaer som identifiserer faktorer som kontaktlinsebruk, røyking, yrke og etc.

Ikke-invasiv rivebruddstid (OCULUS K5M) Ikke-invasiv rivebruddstid måles ikke-invasivt og helautomatisk ved hjelp av OCULUS K5M. Den nye infrarøde belysningen er ikke synlig for det menneskelige øyet. Dette forhindrer gjenskinn under undersøkelsen. Pasienten vil sitte komfortabelt foran instrumentet og blinke fritt mens han fester seg på et mål rett foran. Når deltakeren er klar, vil de bli bedt om å blinke to ganger og avstå fra å blinke. Keratograph 5M er helautomatisert og vil fange opp eventuelle brudd eller forvrengninger i bildet, og tidspunktet for pausen vil bli notert. Tre avlesninger vil bli tatt for hvert øye for å få gjennomsnittsverdien.

Konjunktiva rødhet (OCULUS K5M) Konjunktiva rødhet vil bli vurdert med OCULUS K5M. Pasienten vil sitte komfortabelt foran instrumentet mens han fester seg på et mål rett foran. Bildet vil bli tatt og en oversiktsvisning av rødhet i bindehinnen vil bli evaluert av "JENVIS Grading Scale". JENVIS skala varierer fra 0 til 4.

Rødhetsverdi Definisjon 0 Ingen funn, f.eks. Babyer eller spedbarn

1. Enkeltinjeksjoner, standardverdi for voksne
2. Milde diffuse injeksjoner
3. Alvorlige lokale injeksjoner
4. Alvorlige diffuse injeksjoner

Samling av mikrobiom To prøver av mikrobiom vil bli tatt fra begge øyne. Først: en dråpe ikke-konservert tetrakain vil bli dryppet inn i konjunktival fornix. Etter at den stikkende følelsen har forsvunnet, vil en steril bomullsswap brukes til å samle mikrobene fra den nedre konjunktivale fornix ved hjelp av en forsiktig rullende handling (opptil 8 slag). Prosedyren gjentas deretter for det motsatte øyet.

Disse byttene blir deretter dynket i DNA/RNA Shield (Zymo)-reagens og umiddelbart homogenisert i 1 minutt, stoppet ved 30 sekunder, og holdt på is i 1 minutt, og homogenisert i ytterligere 30 sekunder. Homogeniserte prøver vil bli lagret ved 4°C. Dette sikrer et optimalt og tilstrekkelig DNA/RNA-utbytte for vårt formål. Påfølgende nukleinsyreekstraksjon, PCR, sekvensering og bioinformatikk vil bli utført av våre samarbeidspartnere.

Lagring: beregnet på å bli analysert innen ett år, ikke mer enn 5 år.

Korneal fluoresceinfarging (OCULUS K5M) En dråpe vanlig saltvann vil bli dryppet på fluoresceinstripen (Fluorets) og deretter ristes av slik at ingen synlig dråpe blir igjen. Personen blir bedt om å slå opp før introduksjonen av fluoret til inferior conjunctival fornix på høyre og deretter venstre øye. Korneal fluorescein-farging vil bli avbildet av Keratograph 5M. Poengsystemet vil være basert på CCLRU. Kort fortalt vil det være 5 hornhinnesoner. Fargingsskalaen er 0-4, med 0,5 enhetstrinn i hver av sonene. Til slutt vil det bli tatt et bilde av den fluoresceinfargede hornhinnen.

Schirmers I-test Dette vil bli gjort med standardstrimlene som for tiden brukes på SERI (5 mm brede med et hakk for bretting) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Ingen tidligere bedøvelse vil bli brukt. Strimlene vil plasseres over den nedre temporale halvdelen av den nedre øyelokkskanten i begge øyne samtidig. Studiedeltakeren vil bli bedt om å lukke øynene. Eventuelle tegn på overdreven irritasjon vil bli notert. Omfanget av fuktingen i hver strimmel vil bli registrert etter 5 minutters testing. Strimmelen samles og lagres i 1,5 ml eppendorf-rør ved -80˚C inntil videre analyse.