Microbioma de la superficie ocular en pacientes con ojo seco

La superficie ocular es la primera línea de defensa del ojo, por lo tanto, es donde se detectan las amenazas externas y se neutralizan los posibles insultos. A lo largo de la evolución, varios microbios, especialmente bacterias, han llegado a colonizar la superficie ocular como comensales. Los comensales tienen un papel para mantener la homeostasis de la superficie ocular. 1 La inmunidad innata de la superficie ocular es muy activa y consiste en mecanismos activos para suprimir la inflamación 2. Por ejemplo, existen macrófagos, células dendríticas, células supresoras, células reguladoras, células B, IgA, lisozima, péptidos antimicrobianos y Barreras contra agentes externos. Los comensales normales de la superficie ocular mantienen un nivel basal de activación de la defensa innata al estimular los receptores de reconocimiento de patrones en las células epiteliales de la superficie ocular. Esta composición normal de microbios es importante ya que se producirá inflamación e infección si se introduce una cepa patógena que domina la flora, o si una cepa dominante segrega productos excesivamente inmunogénicos, como la exotoxina A de Staphylococcus que desencadena la queratitis marginal, una forma de hipersensibilidad tipo IV. La carga de flora del microbioma también podría influir en la función lagrimal, ya que se encontró que una mayor carga de flora estaba asociada con una mayor degradación de la mucina 3 y una menor densidad de células del globo 4. Estudios previos [no estoy seguro de qué estudios son estos] en SERI/SNEC también señalar la importancia de los microbios. Por ejemplo, en pacientes con ojo seco, hay un aumento de lisofosfolípidos en la lágrima, y ​​esto puede contribuir a mediadores inflamatorios como el ácido araquidónico y otros metabolitos. Los lisofosfolípidos se forman por reacciones de la fosfolipasa A2, y esta última puede ser de origen microbiano. Dado que el ojo seco es una enfermedad inflamatoria conocida de la superficie ocular, esta es una forma en que los microbios pueden contribuir a la patología.

El microbioma es la suma total del microbio que se encuentra en una ubicación del cuerpo. En el ojo, el microbioma se puede investigar de forma no invasiva debido a la ubicación accesible de la superficie ocular. A pesar de la importancia del microbioma de la superficie ocular, la comprensión de este tema es muy superficial y se basa en gran medida en métodos de cultivo5-10. Esto puede ser engañoso porque algunos de los microbios no son tan susceptibles a los cultivos celulares de rutina y su presencia puede pasar desapercibida o subestimarse su representación 11. La secuenciación metagenómica desarrollada recientemente, en comparación con los cultivos, es ventajosa para obtener una visión imparcial del microbioma11.

Tres estudios previos han evaluado los perfiles de microbioma de la superficie ocular con secuenciación metagenómica de 16s rRNA 4, 12 13. Se observaron diferencias en el microbioma entre sujetos con ojos secos o blefaritis y sujetos sanos. Además, se descubrió una diversidad de flora ocular mucho mayor en comparación con los resultados basados ​​en cultivos bacterianos.

La escuela de ciencias biológicas químicas y ambientales de la Universidad Tecnológica de Nanyang ha evaluado los microbiomas utilizando dichas técnicas. La base de esto es que los organismos procarióticos tienen firmas de ADN únicas que típicamente pueden caracterizar la especie de origen, y la prevalencia relativa de los organismos de diferentes especies puede deducirse de la abundancia relativa de los diferentes ADN detectados. El proyecto global del microbioma humano busca comprender el microbioma en diferentes partes del cuerpo humano. Esto se entiende mejor en el intestino, pero aún no han surgido publicaciones sobre la superficie ocular.

Recientemente nuestros colaboradores han descubierto que 3 bacterias dominaban la superficie ocular del ojo. Estos son Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans y Lactobacillus rhamnosus. Este predominio de 3 tipos de bacterias fue inesperado, ya que la visión dominante de los comensales de la superficie ocular es que domina Staphylococcus coagulasa negativo, seguido de Staphylococcus aureus y Streptococcus, con menos bacterias gram negativas, y algo de Propionibacter spp 11. Entre las 3 especies, Klebsiella pneumonia es un patógeno gram negativo conocido que puede causar queratitis infecciosa y, en algunos casos, endoftalmitis. Las funciones de Pseudoalteromonas y Lactobacillus son completamente desconocidas. La primera es una bacteria gram negativa de vida libre no patógena que se sabe que está presente en entornos marinos. Sorprendentemente, los altos niveles de las 3 bacterias predominantes son relativamente constantes entre los 3 participantes humanos, lo que sugiere una cierta uniformidad en la colonización de la superficie ocular por parte de las bacterias principales en individuos no enfermos.

El microbioma de la superficie ocular se puede estudiar mediante intercambio estéril del fórnix inferior de la conjuntiva seguido de homogeneización y extracción de ADN. La presencia de ADN bacteriano no informa sobre la función de los microbios, ya que incluso los organismos muertos y no proliferantes tienen ADN remanente. La técnica de recolección de muestras también puede producir ARN y, a partir de la PCR de transcripción inversa, es posible determinar la presencia de transcritos microbianos específicos que se encuentran en la superficie ocular. Además, nuestros colaboradores del Politécnico de Nanyang han sido pioneros en las técnicas de espectrometría de masas MALDI TOF que permiten la caracterización de proteomas bacterianos, basándose en la identificación de secuencias peptídicas bacterianas únicas. Juntas, estas técnicas de transcripción de bacterias e investigaciones de proteínas permiten la evaluación de la expresión génica y, en cierta medida, el estado funcional de las bacterias descubiertas. Esto sería extremadamente importante en el caso de microbios que no hayan sido descubiertos previamente en la superficie ocular.

Aparte del evidente avance académico y científico, este proyecto también tiene implicaciones médicas y potencial nueva propiedad intelectual para aplicaciones comerciales. Primero, la comprensión del microbioma es el primer paso para tratar ciertos tipos de enfermedades como la queratitis marginal y la queratitis infecciosa inusual. Sugiere cómo se puede manipular el sistema inmunitario para el tratamiento. En segundo lugar, la prevención de enfermedades e inflamación puede lograrse mediante la administración probiótica de microbios vivos para colonizar la superficie ocular. En tercer lugar, el estudio puede dar lugar a nuevas técnicas y ensayos que identifiquen los microbios y sus componentes, que pueden convertirse en ensayos de diagnóstico clínico.

Tenemos algunos colaboradores de la industria que están interesados ​​en asociarse con nosotros para desarrollar algunas de estas ideas.

1. OBJETIVOS

Nuestro objetivo es realizar un estudio exploratorio para:

1. Determinar la composición del microbioma bacteriano de la superficie ocular humana en voluntarios normales y pacientes con ojo seco
2. Determinar la expresión de genes bacterianos (transcritos bacterianos) que se encuentran en la superficie ocular humana.
3. Caracterizar cualquier rasgo del microbioma que pueda estar relacionado con características clínicas como la edad, el estado de la película lagrimal, la disfunción de las glándulas de Meibomio, la exposición a estímulos ambientales como el tabaquismo, etc.

2. RIESGOS Y BENEFICIOS ESPERADOS Riesgos esperados No se esperan problemas potenciales para este estudio. Sin embargo, habrá algunas molestias leves durante la recolección del microbioma del fórnix conjuntival inferior. Se le dará tetracaína sin conservantes al paciente para minimizar cualquier molestia. También habrá algunas molestias leves durante la prueba de Schimers I.

Beneficios potenciales Con una mayor comprensión de la presencia de varios microbiomas en la superficie ocular, podemos obtener más información sobre el complejo proceso que tiene lugar.

3. POBLACIÓN DE ESTUDIO 3.1. Indicar el número y naturaleza de las materias a matricular. 90 sujetos serán reclutados de la clínica de ojo seco SNEC y la clínica general atendida por el investigador principal. 45 sujetos sin síntomas de ojo seco serán reclutados como controles normales y 45 sujetos con ojo seco sintomático serán reclutados como sujetos de ojo seco.

3.2. Criterios para el Reclutamiento y Proceso de Reclutamiento

1. Para reclutar controles normales: las 8 preguntas sobre los síntomas del ojo seco deben estar libres de síntomas del ojo seco durante la etapa de preselección. (Apéndice 1) Cuestionario modificado según Schein et al.,1997. Para reclutar sujetos con ojo seco: al menos una de las 8 preguntas sobre síntomas de ojo seco debe ser ≥ grado 3
2. Los sujetos cumplen con todos los criterios de inclusión enumerados a continuación.
3. Libre de criterios de exclusión. Se solicitaría el permiso de los médicos tratantes antes de reclutar sujetos. Los sujetos elegibles recibirán asesoramiento sobre el estudio por parte del coordinador del estudio. Si el sujeto está interesado, el coordinador del estudio acompañará al sujeto al nivel 5 de SERI para las evaluaciones pertinentes. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

3.3. Criterios de inclusión

El sujeto debe cumplir con todos los criterios de inclusión para participar en este estudio.

1. Los sujetos deben tener 21 años o más.
2. Dispuesto a realizar todos los exámenes de la vista en este estudio

3.4. Criterio de exclusión

Todos los sujetos que cumplan cualquiera de los criterios de exclusión al inicio del estudio serán excluidos de la participación.

1. Antecedentes conocidos de trastornos de la tiroides (diagnosticados por un médico).
2. Antecedentes conocidos de síndrome de Sjogren o artritis reumatoide (diagnosticada por un médico).
3. Sin cirugía ocular en los últimos 3 meses y LASIK en 1 año.
4. Enfermedades de la superficie ocular como pterigión o enfermedad palpebral/orbitaria evidente con lagoftalmos.
5. Cualquier otro motivo especificado según lo determine el investigador clínico.

4. DISEÑO DEL ESTUDIO Y PROCEDIMIENTOS/METODOLOGÍA

Diseño del estudio:

Estudio observacional -transversal

Nº de visitas:

Solo habrá 1 visita en este estudio.

Duración de estudio:

1 año

Procedimientos:

Recopilación de historial médico y cuestionario de ojo seco Habrá algún cuestionario que consiste en el historial médico y un conjunto estándar de cuestionarios de ojo seco que identifican factores como el uso de lentes de contacto, el tabaquismo, la ocupación, etc.

Tiempo de ruptura lagrimal no invasiva (OCULUS K5M) El tiempo de ruptura lagrimal no invasiva se mide de forma no invasiva y totalmente automática con OCULUS K5M. La nueva iluminación infrarroja no es visible para el ojo humano. Esto evita el deslumbramiento durante el examen. El paciente se sentará cómodamente frente al instrumento y parpadeará libremente mientras se fija en un objetivo directamente al frente. Una vez que el participante esté listo, se le indicará que parpadee dos veces y se abstenga de parpadear. Keratograph 5M está completamente automatizado y capturará cualquier rotura o distorsión en la imagen y se anotará el tiempo de la rotura. Se tomarán tres lecturas para cada ojo para obtener el valor promedio.

Enrojecimiento de la conjuntiva (OCULUS K5M) El enrojecimiento de la conjuntiva se evaluará mediante OCULUS K5M. El paciente se sentará cómodamente frente al instrumento mientras se fija en un objetivo directamente al frente. Se capturarán las imágenes y se evaluará una visualización general del enrojecimiento de la conjuntiva mediante la "Escala de clasificación JENVIS". Rango de escala JENVIS de 0 a 4.

Valor de enrojecimiento Definición 0 Sin hallazgos, p. Bebés o infantes

1. Inyecciones individuales, valor estándar para adultos
2. Inyecciones difusas leves
3. Inyecciones locales severas
4. Inyecciones difusas severas

Recolección de microbioma Se recolectarán dos muestras de microbioma de ambos ojos. Primero: se instilará una gota de tetracaína sin conservantes en el fórnix conjuntival. Una vez que se haya resuelto la sensación de escozor, se usará una torunda de algodón estéril para recolectar los microbios del fórnix conjuntival inferior mediante un suave movimiento de balanceo (hasta 8 pasadas). Luego se repite el procedimiento para el ojo opuesto.

Luego, estos intercambios se sumergirán en el reactivo DNA/RNA Shield (Zymo) y se homogeneizarán inmediatamente durante 1 minuto, se detendrán a los 30 segundos, se mantendrán en hielo durante 1 minuto y se homogeneizarán durante otros 30 segundos. Las muestras homogeneizadas se almacenarán a 4°C. Esto asegura un rendimiento de ADN/ARN óptimo y suficiente para nuestro propósito. Los procedimientos posteriores de extracción de ácidos nucleicos, PCR, secuenciación y bioinformática serán realizados por nuestros colaboradores.

Almacenamiento: destinado a ser analizado dentro de un año, no más de 5 años.

Tinción corneal con fluoresceína (OCULUS K5M) Se instilará una gota de solución salina normal en la tira de fluoresceína (Fluorets) y luego se sacudirá para que no quede ninguna gota visible. Se le pide al sujeto que mire hacia arriba antes de la introducción de la fluorita en el fórnix conjuntival inferior del ojo derecho y luego del izquierdo. La tinción corneal con fluoresceína se visualizará mediante Keratograph 5M. El sistema de puntuación se basará en CCLRU. Brevemente, habrá 5 zonas corneales. La escala de tinción es de 0-4, con pasos de 0,5 unidades en cada una de las zonas. Por último, se tomará una fotografía de la córnea teñida con fluoresceína.

Prueba Schirmers I Se realizará con las tiras estándar que se utilizan actualmente en SERI (5 mm de ancho con una muesca para doblar) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, Reino Unido). No se utilizará anestesia previa. Las tiras se colocarán sobre la mitad temporal inferior del margen del párpado inferior en ambos ojos al mismo tiempo. Se le pedirá al participante del estudio que cierre los ojos. Cualquier signo de irritación excesiva será notado. La extensión de la humectación en cada tira se registrará después de 5 minutos de prueba. La tira se recogerá y almacenará en tubos eppendorf de 1,5 ml a -80 ˚C hasta su posterior análisis.