Szemfelszíni mikrobiom száraz szemű betegeknél

A szem felszíne a szem első védelmi vonala, ezért itt érzékelik a külső fenyegetéseket, és semlegesítik az esetleges sértéseket. Az evolúció során különféle mikrobák, különösen baktériumok kommenzálisként telepedtek meg a szem felszínén. A kommenzálisoknak szerepük van a szemfelszín homeosztázisának fenntartásában. 1 A szemfelszín veleszületett immunitása nagyon aktív, és aktív mechanizmusokból áll a gyulladás visszaszorítására 2. Léteznek például makrofágok, dendritikus sejtek, szupresszor sejtek, szabályozó sejtek, B-sejtek, IgA, lizozim, antimikrobiális peptidek és akadályok a külső tényezőkkel szemben. A szemfelszín normál kommenzálisai fenntartják a veleszületett védekezés aktiválásának alapszintjét azáltal, hogy stimulálják a szemfelszíni hámsejtek mintázatfelismerő receptorait. A mikrobáknak ez a normális összetétele fontos, mivel gyulladást és fertőzést eredményez, ha egy patogén törzs bejut, amely legyőzi a flórát, vagy ha egy domináns törzs túlzottan immunogén termékeket választ ki, mint például a Staphylococcus exotoxin A, amely marginális keratitist vált ki. IV típusú túlérzékenység esetén. A mikrobiom flóraterhelése a könnyfunkciót is befolyásolhatja, mivel a nagyobb flóraterhelés a fokozott mucin lebomlással 3 és a globet sejtsűrűség csökkenésével járt együtt. rámutat a mikrobák fontosságára. Például száraz szemű betegeknél megnövekedett lizofoszfolipidek a könnyben, ami hozzájárulhat a gyulladásos mediátorokhoz, például az arachidonsavhoz és más metabolitokhoz. A lizofoszfolipidek foszfolipáz A2 reakciók során keletkeznek, ez utóbbiak mikrobiális eredetűek lehetnek. Mivel a szemszárazság a szem felszínének ismert gyulladásos betegsége, ez az egyik módja annak, hogy a mikrobák hozzájáruljanak a patológiához.

A mikrobiom a testben található mikrobák összessége. A szemben a mikrobiom non-invazív módon vizsgálható, mivel a szem felszíne jól megközelíthető. A szemfelszíni mikrobiom fontossága ellenére ennek a témának a megértése nagyon felületes, és nagyrészt tenyésztési módszereken alapul5-10. Ez félrevezető lehet, mert egyes mikrobák nem annyira alkalmasak a rutin sejttenyészetekre, és előfordulhat, hogy jelenlétüket nem észlelik, vagy reprezentációjukat alulbecsülik11. A közelmúltban kifejlesztett metagenomikai szekvenálás a tenyészetekhez képest előnyös a mikrobióm elfogultságától mentes képhez11.

Három korábbi tanulmány értékelte a szemfelszín mikrobiomprofilját a 16s rRNS 4, 12 13 metagenomikai szekvenálásával. A mikrobiomában különbségeket figyeltek meg a száraz szemű vagy blepharitisben szenvedő alanyok és az egészséges alanyok között. Ezenkívül a szemflóra sokkal nagyobb változatosságát fedezték fel, mint a bakteriális tenyészeten alapuló eredmények.

A Nanyang Műszaki Egyetem kémiai és környezeti élettudományi iskolája ilyen technikák segítségével értékelte a mikrobiomokat. Ennek az az alapja, hogy a prokarióta szervezetek egyedi DNS-aláírásokkal rendelkeznek, amelyek jellemzően a származási fajt jellemzik, és a különböző fajok élőlényeinek relatív előfordulása a különböző kimutatott DNS-ek relatív mennyiségéből következtethető. A globális emberi mikrobióma projekt célja az emberi test különböző részein található mikrobiom megértése. Ez a legjobban a bélben érthető, de a szem felszínéről még nem születtek publikációk.

A közelmúltban munkatársaink azt találták, hogy 3 baktérium uralta a szem szemfelszínét. Ezek a Klebsiella pneumoniae, a Pseudoalteromonas agarivorans és a Lactobacillus rhamnosus. Ez a 3 típusú baktérium dominanciája váratlan volt, mivel a szemfelszíni kommenzálisok domináns nézete szerint a koaguláz-negatív Staphylococcus dominál, ezt követi a Staphylococcus aureus és a Streptococcus, kevesebb Gram-negatív baktériummal, valamint néhány Propionibacter spp 11. A 3 faj közül a Klebsiella tüdőgyulladás ismert gram-negatív kórokozó, amely fertőző keratitist, illetve egyes esetekben endoftalmitist okozhat. A Pseudoalteromonas és a Lactobacillus szerepe teljesen ismeretlen. Az előbbi egy nem patogén, szabadon élő gram-negatív baktérium, amelyről ismert, hogy tengeri környezetben is előfordul. Meglepő módon a 3 domináns baktérium magas szintje viszonylag állandó a 3 humán résztvevő között, ami arra utal, hogy a nem beteg egyénekben a szemfelszín főbb baktériummikrobák általi kolonizációja bizonyos mértékig egyenletes.

A szemfelszíni mikrobiom a kötőhártya inferior fornixének steril cseréjével, majd a DNS homogenizálásával és extrakciójával tanulmányozható. A baktériumok DNS-ének jelenléte nem tájékoztat a mikrobák működéséről, mivel még az elhalt és nem szaporodó szervezetekben is van DNS-maradvány. A mintagyűjtés technikája RNS-t is eredményezhet, reverz transzkripciós PCR-ből pedig meghatározható a szem felszínén található specifikus mikrobiális transzkriptumok jelenléte. Ezenkívül a Nanyang Polytechnic munkatársai úttörő szerepet játszottak a MALDI TOF tömegspektrometriás technikákban, amelyek lehetővé teszik a bakteriális proteomok jellemzését, egyedi bakteriális peptidszekvenciák azonosítása alapján. Ezek a baktérium-transzkriptum- és fehérjevizsgálati technikák együttesen lehetővé teszik a felfedezett baktériumok génexpressziójának és bizonyos mértékig funkcionális állapotának értékelését. Ez rendkívül fontos lenne olyan mikrobák esetében, amelyeket korábban nem fedeztek fel a szem felszínén.

A nyilvánvaló akadémiai és tudományos fejlődésen kívül ennek a projektnek egészségügyi vonatkozásai is vannak, és potenciálisan új szellemi tulajdont jelenthet kereskedelmi alkalmazásokhoz. Először is, a mikrobiom megértése az első lépés bizonyos típusú betegségek, például marginális keratitis és szokatlan fertőző keratitis kezelésében. Azt sugallja, hogyan lehet manipulálni az immunrendszert a kezeléshez. Másodszor, a betegségek és a gyulladások megelőzése elérhető élő mikrobák probiotikus beadásával, hogy kolonizálják a szem felszínét. Harmadszor, a tanulmány olyan új technikákhoz és vizsgálatokhoz vezethet, amelyek azonosítják a mikrobákat és azok összetevőit, amelyeket klinikai diagnosztikai vizsgálatokká lehet fejleszteni.

Vannak olyan iparági munkatársaink, akik szívesen csatlakoznának hozzánk ezen ötletek kidolgozásában.

1. CÉLKITŰZÉSEK

Célunk, hogy feltáró tanulmányt készítsünk:

1. Határozza meg az emberi szemfelület bakteriális mikrobiomjának összetételét normál önkéntesekben és száraz szemű betegekben
2. Határozza meg az emberi szem felszínén található bakteriális génexpressziót (bakteriális transzkriptumok).
3. Jellemezze a mikrobiom bármely olyan jellemzőjét, amely összefüggésbe hozható olyan klinikai jellemzőkkel, mint az életkor, a könnyfilm állapota, a meibomi mirigyek diszfunkciója, a környezeti stimulációnak való kitettség, például a dohányzás stb.

2. VÁRHATÓ KOCKÁZATOK ÉS ELŐNYÖK Várható kockázatok Ebben a tanulmányban nem várhatók potenciális problémák. Mindazonáltal előfordulhat némi kellemetlenség a mikrobiom összegyűjtése során az alsó kötőhártya fornixéből. Nem tartósítószert tartalmazó tetrakaint adnak a betegnek a kellemetlen érzések minimalizálása érdekében. A Schimers I teszt során némi kellemetlenség is jelentkezik.

Lehetséges előnyök Ha jobban megértjük a különböző mikrobiomok jelenlétét a szem felszínén, további betekintést nyerhetünk a végbemenő összetett folyamatba.

3. TANULMÁNYOSSÁG 3.1. Sorolja fel a beíratandó tárgyak számát és jellegét. 90 alanyt vesznek fel az SNEC száraz szem klinikáról és az általános klinikáról, amelyet a vezető vizsgáló lát el. 45 szemszárazság-tünetekkel nem rendelkező alanyt normál kontrollként, 45 tünetmentes szemszárazságos alanyt pedig száraz szemű alanyként vesznek fel.

3.2. A toborzás és a toborzási folyamat kritériumai

1. A normál kontrollok toborzásához – A száraz szem tüneteire vonatkozó mind a 8 kérdésnek mentesnek kell lennie a száraz szem tüneteitől a szűrés előtti szakaszban. (1. melléklet) A kérdőív Schein et al., 1997 nyomán módosított. Száraz szem vizsgálati alanyok toborzásához – A száraz szem tünetekre vonatkozó 8 kérdés közül legalább egynek 3. fokozatúnak kell lennie
2. Az alanyok megfelelnek az alább felsorolt ​​összes felvételi feltételnek.
3. Kizárási kritériumoktól mentes. Az alanyok felvétele előtt engedélyt kell kérni a kezelőorvosoktól. A jogosult alanyokat a tanulmányi koordinátor tanácsolja a tanulmányozás során. Ha a tárgy felkeltette érdeklődését, a tanulmányi koordinátor elkíséri a tárgyat a SERI 5. szintjére a vonatkozó értékelések elvégzésére. Minden résztvevőtől tájékoztatáson alapuló írásbeli hozzájárulást kell kérni.

3.3. Befogadási kritériumok

A vizsgálatban való részvételhez az alanynak meg kell felelnie az összes felvételi feltételnek.

1. Az alanyoknak 21 éves vagy idősebbnek kell lenniük
2. Hajlandó az összes szemvizsgálat elvégzésére ebben a tanulmányban

3.4. Kizárási kritériumok

Minden olyan alany, amely az alaphelyzetben megfelel a kizárási feltételek bármelyikének, kizárásra kerül a részvételből.

1. Ismert pajzsmirigy-rendellenességek anamnézisében (orvos által diagnosztizált).
2. Ismert Sjogren-szindróma vagy rheumatoid arthritis (orvos által diagnosztizált).
3. Nem volt szemműtét az elmúlt 3 hónapban és LASIK 1 éven belül.
4. Szemfelszíni betegségek, például pterygium vagy nyilvánvaló szemhéj-/szemüreg-betegség lagophthalmosszal.
5. Bármilyen más, a klinikai kutató által meghatározott ok.

4. A TANULMÁNY TERVEZÉSE ÉS ELJÁRÁSAI/MÓDSZERTANA

Dizájnt tanulni:

Megfigyelési - Keresztmetszeti vizsgálat

Látogatások száma:

Ebben a tanulmányban csak 1 látogatás lesz.

A tanulmány időtartama:

1 év

Eljárások:

Orvostörténeti és száraz szem kérdőív gyűjteménye Lesz néhány kérdőív, amely kórtörténetből és száraz szem kérdőívekből áll, amelyek olyan tényezőket azonosítanak, mint a kontaktlencse-használat, a dohányzás, a foglalkozás stb.

A nem invazív könnyezési idő (OCULUS K5M) A nem invazív könnyezési idő mérése nem invazív módon és teljesen automatikusan történik az OCULUS K5M segítségével. Az új infravörös megvilágítás emberi szemmel nem látható. Ez megakadályozza a tükröződést a vizsgálat során. A páciens kényelmesen ül a műszer előtt, és szabadon pislog, miközben egy közvetlenül előtte lévő célpontra rögzíti. Ha a résztvevő készen áll, a rendszer arra utasítja, hogy kétszer pislogjon, és tartózkodjon a pislogástól. A Keratograph 5M teljesen automatizált, és rögzíti a kép bármilyen törését vagy torzulását, és feljegyzi a törés időpontját. Minden szemnél három mérést kell végezni, hogy megkapjuk az átlagos értéket.

A kötőhártya vörössége (OCULUS K5M) A kötőhártya vörösségét az OCULUS K5M segítségével értékeljük. A páciens kényelmesen ülhet a műszer előtt, miközben egy közvetlenül előtte lévő célpontra rögzíti. A képeket rögzíti, és a kötőhártya vörösödésének áttekintő megjelenítését a "JENVIS Grading Scale" értékeli. A JENVIS skála 0-tól 4-ig terjed.

Vörösség érték Definíció 0 Nincs lelet, pl. Csecsemők vagy csecsemők

1. Egyszeri injekció, normál érték felnőtteknek
2. Enyhe diffúz injekciók
3. Súlyos helyi injekciók
4. Súlyos diffúz injekciók

Mikrobióma gyűjtése Mindkét szemből két mikrobiommintát veszünk. Először is: egy csepp nem tartósított tetrakaint csepegtetünk a kötőhártya fornixjába. Miután a szúró érzés megszűnt, egy steril vattacsomóval gyengéd görgetéssel (legfeljebb 8 mozdulattal) összegyűjtik a mikrobákat az alsó kötőhártya fornixéből. Ezután az eljárást meg kell ismételni az ellenkező szemre.

Ezeket a swapokat ezután DNS/RNA Shield (Zymo) reagensbe áztatják, és azonnal homogenizálják 1 percig, 30 másodpercnél leállítják, jégen tartják 1 percig, majd további 30 másodpercig homogenizálják. A homogenizált mintákat 4°C-on kell tárolni. Ez biztosítja a célunknak megfelelő optimális és elegendő DNS/RNS hozamot. Az ezt követő nukleinsav extrakciót, PCR-t, szekvenálást és bioinformatikai eljárásokat munkatársaink végzik.

Tárolás: egy éven belüli, legfeljebb 5 éven belüli elemzésre szánták.

Szaruhártya fluoreszcein festése (OCULUS K5M) Egy csepp normál sóoldatot csepegtetünk a fluoreszcein csíkra (Fluorets), majd lerázzuk, hogy ne maradjon látható csepp. Az alanynak fel kell néznie a fluoret bevezetése előtt a jobb, majd a bal szem inferior conjunctiva fornixére. A szaruhártya fluoreszcein festését a Keratograph 5M leképezi. A pontozási rendszer a CCLRU-n fog alapulni. Röviden, 5 szaruhártya zóna lesz. A festési skála 0-4, 0,5 egység lépésekkel minden zónában. Végül egy kép készül a fluoreszceinnel festett szaruhártyáról.

Schirmers I teszt Ezt a SERI-nél jelenleg használt szabványos csíkokkal kell elvégezni (5 mm széles, bevágással a hajtogatáshoz) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, Egyesült Királyság). Előzetes érzéstelenítést nem alkalmaznak. A csíkok az alsó szemhéj szélének alsó, időbeli fele fölött helyezkednek el mindkét szemen egyszerre. A vizsgálatban résztvevőt megkérjük, hogy csukja be a szemét. A túlzott irritáció jeleit fel kell jegyezni. A nedvesítés mértékét minden csíkban 5 perc tesztelés után rögzítjük. A csíkot összegyűjtjük és 1,5 ml-es Eppendorf-csövekben tároljuk -80 °C-on a további elemzésig.