Okulär ytmikrobiom hos patienter med torra ögon

Okulärytan är ögats första försvarslinje, det är därför där yttre hot uppfattas och potentiella förolämpningar neutraliseras. Under evolutionens gång har olika mikrober, särskilt bakterier, kommit att kolonisera ögonytan som kommensaler. Kommensalerna har en roll att upprätthålla homeostasen av den okulära ytan. 1 Okulärytans medfödda immunitet är mycket aktiv, och består av aktiva mekanismer för att undertrycka inflammation 2. Det finns till exempel makrofager, dendritiska celler, suppressorceller, regulatoriska celler, B-celler, IgA, lysozym, antimikrobiella peptider och hinder mot externa aktörer. De normala kommensalerna av den okulära ytan upprätthåller en basal nivå av aktivering av det medfödda försvaret genom att stimulera mönsterigenkänningsreceptorerna på okulära ytepitelceller. Denna normala sammansättning av mikrober är viktig eftersom inflammation och infektion uppstår om det finns en introduktion av en patogen stam som övervinner floran, eller om en dominant stam utsöndrar överdrivet immunogena produkter, såsom exotoxin A från Staphylococcus som utlöser marginell keratit, en form av typ IV överkänslighet. Florabelastningen av mikrobiom kan också påverka tårfunktionen eftersom en högre florabelastning visade sig vara associerad med ökad mucinnedbrytning 3 och minskad globetcelldensitet 4. Tidigare studier [Jag är inte säker på vilka studier dessa är] vid SERI/SNEC också pekar på vikten av mikrober. Till exempel, hos patienter med torra ögon, finns det ökade lysofosfolipider i tåren, och detta kan bidra till inflammatoriska mediatorer som arakidonsyra och andra metaboliter. Lysofosfolipiderna bildas av fosfolipas A2-reaktioner, och de senare kan vara mikrobiellt ursprung. Eftersom torra ögon är en känd inflammatorisk sjukdom i ögonytan, är detta ett sätt som mikrober kan bidra till patologin.

Mikrobiomet är summan av mikroben som finns på en kroppsplats. I ögat kan mikrobiomet undersökas icke-invasivt på grund av den tillgängliga platsen för ögonytan. Trots vikten av det okulära ytmikrobiomet är förståelsen för detta ämne mycket ytlig och till stor del baserad på odlingsmetoder5-10. Detta kan vara missvisande eftersom vissa av mikroberna inte är så mottagliga för rutincellkulturer och deras närvaro kan vara oupptäckt eller deras representation underskattad 11. Nyutvecklad metagenomisk sekvensering, jämfört med kulturer, är fördelaktiga för att få en opartisk syn på mikrobiom11.

Tre tidigare studier har utvärderat mikrobiomprofilerna för den okulära ytan med metagenomisk sekvensering av 16s rRNA 4, 12 13. Skillnader i mikrobiom observerades mellan försökspersoner med torra ögon eller blefarit och friska försökspersoner. Dessutom upptäcktes en mycket större mångfald av ögonflora jämfört med resultat baserade på bakteriekultur.

Skolan för kemisk och miljölivsvetenskap vid Nanyang Technological University har utvärderat mikrobiomen med hjälp av sådana tekniker. Grunden för detta är att prokaryota organismer har unika DNA-signaturer som typiskt kan karakterisera ursprungsarten, och den relativa förekomsten av organismer av olika arter kan härledas från den relativa mängden av de olika DNA som detekteras. Det globala mänskliga mikrobiomprojektet försöker förstå mikrobiomet i olika delar av människokroppen. Detta förstås bäst i tarmen, men publikationer om ögonytan har ännu inte dykt upp.

Nyligen har våra medarbetare upptäckt att 3 bakterier dominerade den okulära ytan av ögat. Dessa är Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans och Lactobacillus rhamnosus. Denna dominans av tre typer av bakterier var oväntad, eftersom den dominerande synen på ögonytans kommensaler är att koagulasnegativa Staphylococcus dominerar, följt av Staphylococcus aureus och Streptococcus, med färre gramnegativa bakterier, och vissa Propionibacter spp 11. Bland de 3 arterna är Klebsiella pneumoni en känd gramnegativ patogen som kan orsaka infektiös keratit, och i vissa fall endoftalmit. Rollerna för Pseudoalteromonas och Lactobacillus är helt okända. Den förra är en icke-patogen fri levande gramnegativ bakterie som är känd för att finnas i marina miljöer. Överraskande nog är de höga nivåerna av de 3 dominerande bakterierna relativt konstanta bland de 3 mänskliga deltagarna, vilket tyder på en viss enhetlighet i koloniseringen av ögonytan av stora bakteriemikrober hos icke-sjuka individer.

Den okulära ytmikrobiomet kan studeras genom sterilt utbyte av den inferior fornix av bindhinnan följt av homogenisering och extraktion av DNA. Närvaron av bakterie-DNA informerar inte om mikrobernas funktion, eftersom även döda och icke-prolifererande organismer har kvarvarande DNA. Tekniken att samla prover kan också ge RNA, och från omvänd transkriptions-PCR är det möjligt att bestämma närvaron av specifika mikrobiella transkript som finns i ögonytan. Dessutom har våra medarbetare från Nanyang Polytechnic banat väg för MALDI TOF-masspektrometritekniker som möjliggör karakterisering av bakterieproteomer, baserat på identifiering av unika bakteriella peptidsekvenser. Tillsammans möjliggör dessa tekniker för bakterietranskription och proteinundersökningar utvärdering av genuttrycket och i viss mån funktionell status för de upptäckta bakterierna. Detta skulle vara extremt viktigt när det gäller mikrober som inte tidigare har upptäckts på ögonytan.

Förutom de uppenbara akademiska och vetenskapliga framstegen har detta projekt även medicinska implikationer och potentiella nya immateriella rättigheter för kommersiella tillämpningar. För det första är förståelsen av mikrobiomet det första steget för att behandla vissa typer av sjukdomar som marginell keratit och ovanlig infektiös keratit. Det föreslår hur immunsystemet kan manipuleras för behandling. För det andra kan förebyggande av sjukdomar och inflammation uppnås genom probiotisk administrering av levande mikrober för att kolonisera ögonytan. För det tredje kan studien leda till nya tekniker och analyser som identifierar mikrober och deras komponenter som kan utvecklas till kliniska diagnostiska analyser.

Vi har några branschsamarbetare som är intresserade av att samarbeta med oss ​​för att utveckla några av dessa idéer.

1. MÅL

Vi strävar efter att genomföra en explorativ studie för att:

1. Bestäm sammansättningen av bakteriemikrobiomet på den mänskliga ögonytan hos normala frivilliga och patienter med torra ögon
2. Bestäm det bakteriella genuttrycket (bakterietranskript) som finns i den mänskliga ögonytan.
3. Karakterisera alla egenskaper hos mikrobiomet som kan vara kopplade till kliniska egenskaper såsom ålder, status för tårfilm, dysfunktion av Meibomikörteln, exponering för miljöstimulering såsom rökning, etc.

2. FÖRVÄNTADE RIKER OCH FÖRDELAR Förväntade risker Inga potentiella problem förväntas för denna studie. Det kommer dock att finnas en del obehag under insamlingen av mikrobiom från den nedre konjunktivala fornixen. Icke-konserverande tetrakain kommer att ges till patienten för att minimera eventuella obehag. Det kommer också att finnas lite obehag under Schimers I-testet.

Potentiella fördelar Med större förståelse för förekomsten av olika mikrobiomer i ögonytan kan vi få ytterligare insikt i den komplexa process som äger rum.

3. STUDIEPOPULATION 3.1. Ange antalet och arten av ämnen som ska registreras. 90 försökspersoner kommer att rekryteras från SNEC torrögonklinik och allmänklinik som betjänas av huvudutredaren. 45 försökspersoner utan symtom på torra ögon kommer att rekryteras som normala kontroller och 45 försökspersoner med symtomatisk torra ögon kommer att rekryteras som försökspersoner med torra ögon.

3.2. Kriterier för rekrytering och rekryteringsprocess

1. För att rekrytera normala kontroller- Alla de 8 frågorna om symtom på torra ögon måste vara fria från symtom på torra ögon under förundersökningsstadiet. (Bilaga 1) Frågeformulär modifierat efter Schein et al.,1997. För att rekrytera patienter med torra ögon- Minst en av de 8 frågorna om symtom på torra ögon måste vara ≥ grad 3
2. Ämnen uppfyller alla inklusionskriterier som anges nedan.
3. Fri från uteslutningskriterier. Tillstånd skulle begäras från de behandlande läkarna innan försökspersonerna rekryteras. Berättigade ämnen kommer att vägledas om studien av studiekoordinator. Om ämnet är intresserad följer studiesamordnaren sedan med ämnet till SERI nivå 5 för relevanta bedömningar. Informerat skriftligt samtycke kommer att erhållas från alla deltagare.

3.3. Inklusionskriterier

Försökspersonen måste uppfylla alla inklusionskriterier för att delta i denna studie.

1. Ämnen måste vara 21 år eller äldre
2. Vill gärna utföra alla synundersökningar i denna studie

3.4. Exklusions kriterier

Alla försökspersoner som uppfyller något av uteslutningskriterierna vid baslinjen kommer att uteslutas från deltagande.

1. Känd historia av sköldkörtelsjukdomar (diagnostiserad av läkare).
2. Känd historia av Sjögrens syndrom eller reumatoid artrit (diagnostiserat av läkare).
3. Ingen ögonoperation under de senaste 3 månaderna och LASIK inom 1 år.
4. Okulära ytsjukdomar som pterygium, eller uppenbar lock-/orbitalsjukdom med lagoftalmos.
5. Alla andra specificerade skäl som fastställts av den kliniska prövaren.

4. STUDIEDESIGN OCH PROCEDURER/METOD

Studera design:

Observations-Tvärsnittsstudie

Antal besök:

Det blir bara 1 besök i denna studie.

Studietid:

1 år

Tillvägagångssätt:

Insamling av medicinsk historia och torra ögon-enkät Det kommer att finnas ett frågeformulär som består av medicinsk historia och en standarduppsättning av frågeformulär för torra ögon som identifierar faktorer som användning av kontaktlinser, rökning, yrke och så vidare.

Icke-invasiv tårbrytningstid (OCULUS K5M) Icke-invasiv tåruppbrytningstid mäts icke-invasivt och helt automatiskt med OCULUS K5M. Den nya infraröda belysningen är inte synlig för det mänskliga ögat. Detta förhindrar bländning under undersökningen. Patienten kommer att sitta bekvämt framför instrumentet och blinka fritt medan han fixerar på ett mål direkt framför. När deltagaren är redo kommer de att bli instruerade att blinka två gånger och avstå från att blinka. Keratograph 5M är helt automatiserad och den kommer att fånga eventuella avbrott eller förvrängningar i bilden och tidpunkten för avbrottet kommer att noteras. Tre avläsningar kommer att göras för varje öga för att få medelvärdet.

Konjunktivrodnad (OCULUS K5M) Konjunktivrodnad kommer att bedömas med OCULUS K5M. Patienten kommer att sitta bekvämt framför instrumentet medan han fixerar på ett mål direkt framför. Bilden kommer att fångas och en översiktlig visning av konjunktiva rodnad kommer att utvärderas av "JENVIS Grading Scale". JENVIS skala sträcker sig från 0 till 4.

Rödhetsvärde Definition 0 Inga fynd, t.ex. Bebisar eller spädbarn

1. Enstaka injektioner, standardvärde för vuxna
2. Milda diffusa injektioner
3. Allvarliga lokala injektioner
4. Allvarliga diffusa injektioner

Samling av mikrobiom Två prover av mikrobiom kommer att tas från båda ögonen. Först: en droppe icke-konserverad tetrakain kommer att instilleras i konjunktival fornix. Efter att den stickande känslan har försvunnit kommer ett sterilt bomullsbyte att användas för att samla in mikroberna från den nedre konjunktivala fornixen med en mjuk rullande rörelse (upp till 8 slag). Proceduren upprepas sedan för det motsatta ögat.

Dessa byten kommer sedan att blötläggas i DNA/RNA Shield (Zymo)-reagens och omedelbart homogeniseras i 1 minut, stoppas vid 30 sekunder och hållas på is i 1 minut och homogeniseras i ytterligare 30 sekunder. Homogeniserade prover kommer att förvaras vid 4°C. Detta säkerställer ett optimalt och tillräckligt DNA/RNA-utbyte för vårt syfte. Efterföljande nukleinsyraextraktion, PCR, sekvensering och bioinformatik kommer att utföras av våra medarbetare.

Lagring: avsedd att analyseras inom ett år, inte mer än 5 år.

Hornhinnafluoresceinfärgning (OCULUS K5M) En droppe normal koksaltlösning kommer att instilleras på fluoresceinremsan (Fluorets) och skakas sedan av så att inga synliga droppar finns kvar. Försökspersonen uppmanas att slå upp innan fluoreten introduceras till den inferior konjunktivala fornixen på höger och sedan vänster öga. Korneal fluoresceinfärgning kommer att avbildas av Keratograph 5M. Poängsystemet kommer att baseras på CCLRU. Kortfattat kommer det att finnas 5 hornhinnezoner. Färgningsskalan är 0-4, med 0,5 enhetssteg i var och en av zonerna. Slutligen kommer en bild av den fluoresceinfärgade hornhinnan att tas.

Schirmers I-test Detta kommer att göras med de standardremsor som för närvarande används på SERI (5 mm breda med en skåra för vikning) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Ingen tidigare bedövning kommer att användas. Remsorna kommer att placeras över den nedre temporala halvan av den nedre ögonlockskanten i båda ögonen samtidigt. Studiedeltagaren kommer att bli ombedd att blunda. Eventuella tecken på överdriven irritation kommer att noteras. Omfattningen av vätningen i varje remsa kommer att registreras efter 5 minuters testning. Remsan kommer att samlas upp och förvaras i 1,5 ml eppendorf-rör vid -80˚C tills vidare analys.