Mikrobiom očního povrchu u pacientů se suchým okem

Oční povrch je první obrannou linií oka, je tedy místem, kde jsou vnímány vnější hrozby a neutralizovány potenciální urážky. V průběhu evoluce se různé mikroby, zejména bakterie, dostaly do kolonizace povrchu oka jako komenzálové. Úlohou komenzálů je udržovat homeostázu očního povrchu. 1 Vrozená imunita očního povrchu je velmi aktivní a sestává z aktivních mechanismů k potlačení zánětu 2. Existují například makrofágy, dendritické buňky, supresorové buňky, regulační buňky, B buňky, IgA, lysozym, antimikrobiální peptidy a další. bariéry proti vnějším činitelům. Normální komenzály očního povrchu udržují základní úroveň aktivace vrozené obrany stimulací receptorů pro rozpoznávání vzorů na epiteliálních buňkách očního povrchu. Toto normální složení mikrobů je důležité, protože dojde k zánětu a infekci, pokud dojde k zavlečení patogenního kmene, který překonává flóru, nebo pokud dominantní kmen vylučuje nadměrně imunogenní produkty, jako je exotoxin A Staphylococcus, který spouští marginální keratitidu, formu přecitlivělosti typu IV. Flórová zátěž mikrobiomu by mohla také ovlivnit funkci slz, protože bylo zjištěno, že vyšší florová zátěž souvisí se zvýšenou degradací mucinu 3 a sníženou hustotou globetových buněk 4. Předchozí studie [nejsem si jistý, které studie to jsou] na SERI/SNEC také poukazují na důležitost mikrobů. Například u pacientů se suchým okem je v slzách zvýšený obsah lysofosfolipidů, což může přispívat k zánětlivým mediátorům, jako je kyselina arachidonová a další metabolity. Lysofosfolipidy jsou tvořeny reakcemi fosfolipázy A2 a ty mohou být mikrobiálního původu. Vzhledem k tomu, že suché oko je známé zánětlivé onemocnění očního povrchu, je to jeden ze způsobů, jak mohou mikroby přispět k patologii.

Mikrobiom je souhrn všech mikrobů nalezených v místě těla. V oku lze mikrobiom vyšetřovat neinvazivně díky dostupnému umístění očního povrchu. Navzdory důležitosti mikrobiomu očního povrchu je chápání tohoto tématu velmi povrchní a z velké části založeno na kultivačních metodách5-10. To může být zavádějící, protože některé z mikrobů nejsou tak přístupné rutinním buněčným kulturám a jejich přítomnost může být nezjištěná nebo jejich zastoupení podhodnocené 11. Nedávno vyvinuté metagenomické sekvenování je ve srovnání s kulturami výhodné pro získání nezaujatého pohledu na mikrobiom11.

Tři předchozí studie hodnotily mikrobiomové profily očního povrchu s metagenomickým sekvenováním 16s rRNA 4, 12 13. Rozdíly v mikrobiomu byly pozorovány mezi subjekty se suchýma očima nebo blefaritidou a zdravými subjekty. Navíc byla objevena mnohem větší rozmanitost oční flóry ve srovnání s výsledky založenými na bakteriální kultuře.

Škola chemické a environmentální vědy o živé přírodě na Technologické univerzitě Nanyang vyhodnotila mikrobiomy pomocí těchto technik. Základem toho je, že prokaryotické organismy mají jedinečné podpisy DNA, které mohou typicky charakterizovat druh původu, a relativní prevalenci organismů různých druhů lze odvodit z relativního množství různých detekovaných DNA. Globální projekt lidského mikrobiomu se snaží porozumět mikrobiomu v různých částech lidského těla. To je nejlépe pochopitelné ve střevě, ale publikace o očním povrchu se ještě neobjevily.

Nedávno naši spolupracovníci zjistili, že na povrchu oka dominovaly 3 bakterie. Jedná se o Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans a Lactobacillus rhamnosus. Tato dominance 3 typů bakterií byla neočekávaná, protože dominantní pohled na komenzály očního povrchu je ten, že dominuje koaguláza negativní Staphylococcus, následovaný Staphylococcus aureus a Streptococcus s méně gramnegativními bakteriemi a některými Propionibacter spp 11. Mezi 3 druhy je Klebsiella pneumonia známý gramnegativní patogen, který může způsobit infekční keratitidu a v některých případech endoftalmitidu. Role Pseudoalteromonas a Lactobacillus jsou zcela neznámé. První jmenovaná je nepatogenní volně žijící gramnegativní bakterie, o které je známo, že se vyskytuje v mořských prostředích. Překvapivě jsou vysoké hladiny 3 převládajících bakterií relativně konstantní mezi 3 lidskými účastníky, což naznačuje určitou míru uniformity v kolonizaci očního povrchu hlavními bakteriálními mikroby u jedinců bez onemocnění.

Mikrobiom očního povrchu lze studovat sterilní výměnou dolního fornixu spojivky s následnou homogenizací a extrakcí DNA. Přítomnost bakteriální DNA neinformuje o funkci mikrobů, protože i mrtvé a nemnožící se organismy mají zbytky DNA. Technika odběru vzorků může také poskytnout RNA a z reverzní transkripční PCR je možné určit přítomnost specifických mikrobiálních transkriptů, které se nacházejí na povrchu oka. Kromě toho naši spolupracovníci z Nanyang Polytechnic vyvinuli techniky hmotnostní spektrometrie MALDI TOF, které umožňují charakterizaci bakteriálních proteomů na základě identifikace jedinečných bakteriálních peptidových sekvencí. Společně tyto techniky bakteriálního transkriptu a zkoumání proteinů umožňují vyhodnocení genové exprese a do určité míry funkčního stavu objevených bakterií. To by bylo extrémně důležité v případě mikrobů, které nebyly dosud na povrchu oka objeveny.

Kromě zřejmého akademického a vědeckého pokroku má tento projekt také lékařské důsledky a potenciální nové duševní vlastnictví pro komerční aplikace. Za prvé, pochopení mikrobiomu je prvním krokem k léčbě určitých typů onemocnění, jako je marginální keratitida a neobvyklá infekční keratitida. Naznačuje, jak lze imunitní systém manipulovat pro léčbu. Za druhé, prevence onemocnění a zánětu může být dosaženo probiotickým podáváním živých mikrobů ke kolonizaci očního povrchu. Za třetí, studie může vést k novým technikám a testům, které identifikují mikroby a jejich složky, které lze rozvinout do klinických diagnostických testů.

Máme několik spolupracovníků v oboru, kteří mají zájem s námi spolupracovat na vývoji některých z těchto nápadů.

1. CÍLE

Naším cílem je provést průzkumnou studii:

1. Určete složení bakteriálního mikrobiomu povrchu lidského oka u normálních dobrovolníků a pacientů se suchým okem
2. Určete expresi bakteriálního genu (bakteriální transkripty) nacházející se na povrchu lidského oka.
3. Charakterizujte jakýkoli rys mikrobiomu, který může být spojen s klinickými charakteristikami, jako je věk, stav slzného filmu, dysfunkce Meibomské žlázy, vystavení stimulaci prostředí, jako je kouření atd.

2. OČEKÁVANÁ RIZIKA A VÝHODY Očekávaná rizika U této studie se neočekávají žádné potenciální problémy. Během odběru mikrobiomu z dolního spojivkového fornixu však dojde k mírnému nepohodlí. Pacientovi bude podán nekonzervační tetrakain, aby se minimalizovaly jakékoli nepohodlí. Během testu Schimers I dojde také k mírnému nepohodlí.

Potenciální výhody S lepším pochopením přítomnosti různých mikrobiomů na očním povrchu můžeme získat další pohled na složitý proces, který se odehrává.

3. STUDOVANÁ POPULACE 3.1. Uveďte počet a povahu předmětů, které mají být zapsány. 90 subjektů bude přijato z kliniky suchého oka SNEC a všeobecné kliniky obsluhované hlavním zkoušejícím. 45 subjektů bez příznaků suchého oka bude přijato jako normální kontroly a 45 subjektů se symptomatickým suchým okem bude vybráno jako subjekty se suchým okem.

3.2. Kritéria pro nábor a proces náboru

1. Nábor normálních kontrol – Všech 8 otázek o symptomech suchého oka musí být bez symptomů suchého oka během fáze předběžného screeningu. (Příloha 1) Dotazník upravený podle Scheina et al.,1997. Nábor subjektů se suchým okem – Alespoň jedna z 8 otázek o symptomech suchého oka musí být ≥ 3.
2. Subjekty splňují všechna níže uvedená kritéria pro zařazení.
3. Zrušte kritéria vyloučení. Před náborem subjektů by bylo požadováno povolení od ošetřujících lékařů. Oprávněným subjektům bude ke studiu konzultován studijní koordinátor. V případě zájmu o předmět pak studijní koordinátor doprovodí předmět do SERI úrovně 5 na příslušná hodnocení. Od všech účastníků bude získán informovaný písemný souhlas.

3.3. Kritéria pro zařazení

Subjekt musí splnit všechna zařazovací kritéria, aby se mohl zúčastnit této studie.

1. Subjekty musí být starší 21 let
2. Ochotný provést všechna oční vyšetření v této studii

3.4. Kritéria vyloučení

Z účasti budou vyloučeni všichni jedinci splňující některá z vylučovacích kritérií na začátku studie.

1. Známá anamnéza poruch štítné žlázy (diagnostikovaná lékařem).
2. Známá anamnéza Sjogrenova syndromu nebo revmatoidní artritidy (diagnostikovaná lékařem).
3. Žádná oční operace za poslední 3 měsíce a LASIK do 1 roku.
4. Onemocnění očního povrchu, jako je pterygium, nebo zjevné onemocnění víčka/orbity s lagoftalmem.
5. Jakýkoli jiný specifikovaný důvod stanovený klinickým zkoušejícím.

4. NÁVRH A POSTUPY/METODIKA STUDIE

Studovat design:

Observační - Průřezová studie

Počet návštěv:

V této studii bude pouze 1 návštěva.

Délka studia:

1 rok

Postupy:

Sběr anamnézy a dotazník suchého oka Bude existovat určitý dotazník, který se skládá z anamnézy a standardní sady dotazníků pro suché oko, které identifikují faktory, jako je používání kontaktních čoček, kouření, zaměstnání atd.

Doba rozlomení neinvazivního roztržení (OCULUS K5M) Doba rozlomení neinvazivního roztržení se měří neinvazivně a plně automaticky pomocí přístroje OCULUS K5M. Nové infračervené osvětlení není pro lidské oko viditelné. Tím se zabrání oslnění během vyšetření. Pacient bude pohodlně sedět před přístrojem a bude volně mrkat, zatímco se bude fixovat na cíl přímo před ním. Jakmile bude účastník připraven, dostane pokyn, aby dvakrát mrkl a nemrkal. Keratograph 5M je plně automatizovaný a zachytí jakékoli přerušení nebo zkreslení obrazu a čas přerušení bude zaznamenán. Pro každé oko se provedou tři měření, aby se získala průměrná hodnota.

Zarudnutí spojivky (OCULUS K5M) Zarudnutí spojivky bude hodnoceno pomocí OCULUS K5M. Pacient bude pohodlně sedět před nástrojem, zatímco bude fixovat cíl přímo před ním. Snímek bude zachycen a celkové zobrazení zarudnutí spojivek bude vyhodnoceno pomocí "JENVIS Grading Scale". Rozsah stupnice JENVIS od 0 do 4.

Hodnota zarudnutí Definice 0 Žádné nálezy, např. Miminka nebo kojenci

1. Jednotlivé injekce, standardní hodnota pro dospělé
2. Mírné difúzní injekce
3. Závažné lokální injekce
4. Těžké difuzní injekce

Odběr mikrobiomu Z obou očí budou odebrány dva vzorky mikrobiomu. Za prvé: kapka nekonzervovaného tetrakainu se vkape do spojivkového fornixu. Po odeznění pocitu píchání se použije sterilní vatový tampon k odběru mikrobů z dolního spojivkového fornixu pomocí jemného rolování (až 8 tahů). Postup se poté opakuje pro opačné oko.

Tyto swapy se poté namočí do DNA/RNA Shield (Zymo) činidla a okamžitě homogenizují po dobu 1 minuty, zastaví se na 30 sekundách a ponechá na ledu po dobu 1 minuty a homogenizuje dalších 30 sekund. Homogenizované vzorky budou skladovány při 4°C. To zajišťuje optimální a dostatečný výtěžek DNA/RNA pro náš účel. Následnou extrakci nukleové kyseliny, PCR, sekvenování a bioinformatické postupy provedou naši spolupracovníci.

Skladování: určeno k analýze do jednoho roku, ne déle než 5 let.

Barvení rohovky fluoresceinem (OCULUS K5M) Na fluoresceinový proužek (Fluorets) se nakape kapka normálního fyziologického roztoku a poté se setřese, aby nezůstala žádná viditelná kapka. Subjekt je požádán, aby vzhlédl před zavedením fluorety do dolního spojivkového fornixu na pravém a poté levém oku. Barvení rohovky fluoresceinem bude zobrazeno pomocí Keratograph 5M. Bodovací systém bude založen na CCLRU. Stručně řečeno, bude to 5 zón rohovky. Stupnice barvení je 0-4, s 0,5 jednotkovými kroky v každé ze zón. Nakonec bude pořízen snímek rohovky obarvené fluoresceinem.

Test Schirmers I Tento test bude proveden se standardními proužky, které se v současnosti používají u SERI (šířka 5 mm se zářezem pro skládání) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Nebude použito žádné předchozí anestetikum. Proužky budou umístěny přes dolní temporální polovinu okraje dolního víčka u obou očí současně. Účastník studie bude požádán, aby zavřel oči. Jakékoli známky nadměrného podráždění budou zaznamenány. Rozsah smáčení v každém proužku bude zaznamenán po 5 minutách testování. Proužek se shromáždí a uloží do 1,5ml eppendorfových zkumavek při -80 °C až do další analýzy.