안구건조증 환자의 안구 표면 마이크로바이옴

안구 표면은 눈의 첫 번째 방어선이므로 외부 위협이 감지되고 잠재적 손상이 중화되는 곳입니다. 진화 과정에서 다양한 미생물, 특히 박테리아가 공생체로서 안구 표면을 식민지화하게 되었습니다. 공생체는 안구 표면의 항상성을 유지하는 역할을 한다. 1 안구표면의 선천면역은 매우 활동적이며 염증을 억제하는 능동적인 기전으로 구성되어 있다. 외부 에이전트에 대한 장벽. 안구 표면의 정상적인 공생체는 안구 표면 상피 세포의 패턴 인식 수용체를 자극하여 선천적 방어 활성화의 기본 수준을 유지합니다. 미생물의 이러한 정상적인 구성은 세균총을 극복하는 병원성 균주의 도입이 있거나 지배적인 균주가 변연각막염을 유발하는 포도상구균의 외독소 A와 같은 과도한 면역원성 생성물을 분비하는 경우 염증과 감염이 발생하기 때문에 중요합니다. 유형 IV 과민증. 미생물군집의 균총 부하는 또한 눈물 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 더 높은 균총 부하가 점액 분해 증가 3 및 글로브 세포 밀도 감소 4와 관련이 있는 것으로 밝혀졌기 때문입니다. 미생물의 중요성을 지적합니다. 예를 들어, 안구 건조증 환자의 경우 눈물에 리소인지질이 증가하며 이는 아라키돈산 및 기타 대사 물질과 같은 염증 매개체에 기여할 수 있습니다. 리소인지질은 포스포리파제 A2 반응에 의해 형성되며 후자는 미생물 기원일 수 있습니다. 안구 건조증은 안구 표면의 알려진 염증성 질환이기 때문에 이것은 미생물이 병리학에 기여할 수 있는 한 가지 방법입니다.

마이크로바이옴은 신체 위치에서 발견되는 미생물의 총합입니다. 눈에서 마이크로바이옴은 안구 표면의 접근 가능한 위치 때문에 비침습적으로 조사할 수 있습니다. 안구 표면 마이크로바이옴의 중요성에도 불구하고, 이 주제에 대한 이해는 매우 피상적이며 주로 배양 방법5-10을 기반으로 합니다. 이것은 일부 미생물이 일상적인 세포 배양에 순응하지 않고 그들의 존재가 감지되지 않거나 그들의 표현이 과소 평가될 수 있기 때문에 오해의 소지가 있을 수 있습니다 11. 최근에 개발된 metagenomics 시퀀싱은 문화에 비해 microbiome11의 편향되지 않은 관점을 얻는 데 유리합니다.

3개의 이전 연구는 16s rRNA 4, 12 13의 metagenomics sequencing으로 안구 표면의 미생물 군집 프로필을 평가했습니다. 안구건조증이나 안검염이 있는 피험자와 건강한 피험자 사이에 마이크로바이옴의 차이가 관찰되었습니다. 더욱이, 세균 배양에 기초한 결과와 비교할 때 훨씬 더 다양한 안구 식물상이 발견되었습니다.

Nanyang Technological University의 화학 및 환경 생명 과학 학교는 이러한 기술을 사용하여 미생물 군집을 평가했습니다. 이것의 기초는 원핵 유기체가 일반적으로 기원의 종을 특성화할 수 있는 고유한 DNA 서명을 가지고 있고 다른 종의 유기체의 상대적 유병률은 검출된 다른 DNA의 상대적 풍부함에서 추론될 수 있다는 것입니다. 글로벌 휴먼 마이크로바이옴 프로젝트는 인체의 여러 부분에 있는 마이크로바이옴을 이해하고자 합니다. 이것은 장에서 가장 잘 이해되지만 안구 표면에 대한 간행물은 아직 나오지 않았습니다.

최근 우리 공동 연구자들은 3개의 박테리아가 눈의 안구 표면을 지배한다는 사실을 발견했습니다. 이들은 Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans 및 Lactobacillus rhamnosus입니다. 3가지 유형의 박테리아가 우세한 것은 안구 표면 공생균의 우세한 견해가 응고효소 음성 포도상구균이 우세하고 그 다음으로 그람 음성 박테리아가 적은 황색포도상구균과 연쇄상구균, 일부 프로피오니박터 spp 11이 우세하기 때문입니다. 3종 중 Klebsiella pneumonia는 그람 음성 병원체로 알려져 있으며 감염성 각막염, 경우에 따라 안내염을 일으킬 수 있습니다. Pseudoalteromonas와 Lactobacillus의 역할은 완전히 알려져 있지 않습니다. 전자는 해양 환경에 존재하는 것으로 알려진 비병원성 자유 생활 그램 음성 박테리아입니다. 놀랍게도 3가지 우세한 박테리아의 높은 수준은 3명의 인간 참여자 사이에서 상대적으로 일정하며, 이는 질병에 걸리지 않은 개인의 주요 박테리아 미생물에 의한 안구 표면의 집락화에서 일정량의 균일성을 시사합니다.

안구 표면 마이크로바이옴은 결막의 하부 포닉스의 무균 스와핑에 이어 DNA의 균질화 및 추출에 의해 연구될 수 있습니다. 박테리아 DNA의 존재는 미생물의 기능에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 죽어서 증식하지 않는 유기체도 잔여 DNA를 가지고 있기 때문입니다. 샘플을 수집하는 기술도 RNA를 산출할 수 있으며, 역전사 PCR을 통해 안구 표면에서 발견되는 특정 미생물 전사체의 존재를 확인할 수 있습니다. 또한 Nanyang Polytechnic의 협력자들은 고유한 박테리아 펩타이드 서열의 식별을 기반으로 박테리아 프로테옴의 특성화를 허용하는 MALDI TOF 질량 분석 기술을 개척했습니다. 함께, 박테리아 전사 및 단백질 조사의 이러한 기술은 유전자 발현 및 발견된 박테리아의 기능적 상태를 어느 정도 평가할 수 있게 합니다. 이것은 이전에 안구 표면에서 발견되지 않은 미생물의 경우에 매우 중요할 것입니다.

명백한 학문적 및 과학적 발전 외에도 이 프로젝트는 의학적 의미와 상업적 응용을 위한 잠재적인 새로운 지적 재산권을 가지고 있습니다. 첫째, 마이크로바이옴에 대한 이해는 변연부 각막염, 비정상 감염성 각막염과 같은 특정 유형의 질병을 치료하기 위한 첫 번째 단계입니다. 이는 치료를 위해 면역 체계를 조작할 수 있는 방법을 제시합니다. 둘째, 질병 및 염증의 예방은 안구 표면에 군락을 형성하기 위해 살아있는 미생물의 프로바이오틱 투여에 의해 달성될 수 있다. 셋째, 이 연구는 임상 진단 분석법으로 개발될 수 있는 미생물과 그 구성 요소를 식별하는 새로운 기술과 분석법으로 이어질 수 있습니다.

우리는 이러한 아이디어 중 일부를 개발하기 위해 우리와 협력하는 데 관심이 있는 일부 업계 협력자를 보유하고 있습니다.

1. 목표

우리는 다음과 같은 탐색적 연구를 수행하는 것을 목표로 합니다.

1. 정상 지원자와 안구 건조증 환자의 인간 안구 표면의 박테리아 미생물군집 구성을 결정합니다.
2. 인간의 안구 표면에서 발견되는 세균 유전자 발현(세균 전사체)을 결정합니다.
3. 나이, 눈물막 상태, 마이봄샘 기능 장애, 흡연과 같은 환경적 자극에 대한 노출 등과 같은 임상적 특징과 연결될 수 있는 미생물 군집의 모든 특징을 특성화합니다.

2. 예상 위험 및 이점 예상 위험 이 연구에서 예상되는 잠재적인 문제는 없습니다. 그러나 하부 결막원개에서 마이크로바이옴을 수집하는 동안 약간의 불편함이 있을 것입니다. 비보존제 테트라카인을 환자에게 투여하여 불편함을 최소화합니다. 또한 Schimers I 테스트 중에 약간의 불편함이 있을 수 있습니다.

잠재적 이점 안구 표면에 존재하는 다양한 마이크로바이옴에 대한 이해를 통해 발생하는 복잡한 프로세스에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

3. 연구 모집단 3.1. 등록할 과목의 수와 특성을 나열하십시오. SNEC 안구건조증 클리닉 및 주임 연구원이 서비스하는 일반 클리닉에서 90명의 피험자를 모집합니다. 안구 건조 증상이 없는 45명의 피험자를 정상 대조군으로 모집하고 증상이 있는 안구 건조증이 있는 45명의 피험자를 안구 건조 피험자로 모집합니다.

3.2. 채용기준 및 채용절차

1. 정상 대조군을 모집하려면 안구건조증에 대한 8개 문항 모두 사전 선별 단계에서 안구건조증 증상이 없어야 한다. (부록 1) Schein et al.,1997 이후 수정된 설문지. 안구건조증 대상자 모집 - 안구건조증에 대한 8개 문항 중 1개 이상이 3등급 이상이어야 함
2. 피험자는 아래 나열된 모든 포함 기준을 충족합니다.
3. 제외 기준이 없습니다. 피험자를 모집하기 전에 주치의의 허가를 받아야 합니다. 적격 피험자는 연구 코디네이터가 연구에 대해 상담할 것입니다. 피험자가 관심이 있는 경우 연구 코디네이터는 관련 평가를 위해 SERI 레벨 5로 피험자를 동반합니다. 모든 참가자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻습니다.

3.3. 포함 기준

피험자는 이 연구에 참여하기 위해 모든 포함 기준을 충족해야 합니다.

1. 피험자는 21세 이상이어야 합니다.
2. 이 연구에서 모든 시력 검사를 수행할 의향이 있음

3.4. 제외 기준

베이스라인에서 임의의 제외 기준을 충족하는 모든 피험자는 참여에서 제외됩니다.

1. 갑상선 질환의 알려진 병력(의사가 진단함).
2. 쇼그렌 증후군 또는 류마티스 관절염의 알려진 병력(의사가 진단함).
3. 최근 3개월 이내 안과 수술, 1년 이내 라식 수술 없음.
4. 익상편과 같은 안구 표면 질환 또는 토안구증을 동반한 명백한 눈꺼풀/안와 질환.
5. 임상 조사자가 결정한 기타 명시된 이유.

4. 연구 설계 및 절차/방법론

연구 설계:

관찰 - 횡단면 연구

방문 횟수:

이 연구에서는 1회만 방문할 것입니다.

공부 기간:

일년

절차:

병력 및 안구건조증 설문지 수집 병력 및 콘택트렌즈 사용, 흡연, 직업 등과 같은 요인을 식별하는 안구건조증 설문지의 표준 세트로 구성된 일부 설문지가 있습니다.

비침습적 눈물 분해 시간(OCULUS K5M) 비침습적 눈물 분해 시간은 OCULUS K5M을 사용하여 완전 자동으로 비침습적으로 측정됩니다. 새로운 적외선 조명은 사람의 눈에 보이지 않습니다. 이는 검사 중 눈부심을 방지합니다. 환자는 기기 앞에 편안하게 앉아 바로 앞에 있는 대상에 고정하면서 자유롭게 눈을 깜박입니다. 참가자가 준비되면 두 번 깜박이고 깜박임을 자제하라는 지시를 받습니다. Keratograph 5M은 완전히 자동화되어 있으며 이미지의 끊김이나 왜곡을 캡처하고 끊김 시간을 기록합니다. 평균값을 얻기 위해 각 눈에 대해 세 번의 판독 값이 수행됩니다.

결막 충혈(OCULUS K5M) 결막 충혈은 OCULUS K5M을 사용하여 평가합니다. 환자는 바로 앞에 있는 대상에 고정하면서 기구 앞에 편안하게 앉습니다. 이미지가 캡처되고 결막 발적의 개요 표시가 "JENVIS Grading Scale"로 평가됩니다. JENVIS 척도 범위는 0에서 4까지입니다.

발적 값 정의 0 결과 없음, 예. 아기 또는 유아

1. 단회 주사, 성인 기준치
2. 가벼운 확산 주사
3. 심한 국소 주사
4. 심한 확산 주사

마이크로바이옴 수집 두 눈에서 마이크로바이옴 표본 2개를 수집합니다. 첫째: 보존되지 않은 테트라카인 한 방울을 결막원개에 주입합니다. 따가운 느낌이 해결된 후 멸균 면봉을 사용하여 부드러운 롤링 동작(최대 8회 스트로크)을 사용하여 하부 결막원개에서 미생물을 수집합니다. 그런 다음 반대쪽 눈에 대해 절차를 반복합니다.

그런 다음 이러한 스왑을 DNA/RNA Shield(Zymo) 시약에 담그고 즉시 1분 동안 균질화하고 30초에서 멈추고 1분 동안 얼음에 유지한 다음 다시 30초 동안 균질화합니다. 균질화된 샘플은 4°C에서 보관됩니다. 이것은 우리의 목적에 맞는 최적의 충분한 DNA/RNA 수율을 보장합니다. 후속 핵산 추출, PCR, 시퀀싱 및 생물 정보학 절차는 공동 작업자가 수행합니다.

보관: 5년 이내, 1년 이내 분석 예정.

각막 플루오레세인 염색(OCULUS K5M) 플루오레세인 스트립(Fluorets)에 일반 식염수 한 방울을 떨어뜨린 다음 눈에 보이는 방울이 남지 않도록 털어냅니다. 피험자는 오른쪽 눈과 왼쪽 눈의 아래쪽 결막원개에 형석을 도입하기 전에 위를 올려다 보도록 요청받습니다. 각막 플루오레세인 염색은 Keratograph 5M으로 영상화됩니다. 채점 시스템은 CCLRU를 기반으로 합니다. 간단히 말해서, 5개의 각막 영역이 있을 것입니다. 염색 척도는 0-4이며 각 영역에서 0.5 단위 단계입니다. 마지막으로 플루오레세인 염색 각막 사진을 찍습니다.

Schirmers I 테스트 이것은 현재 SERI에서 사용되는 표준 스트립(폴딩용 노치가 있는 폭 5mm)(Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK)으로 수행됩니다. 사전 마취제는 사용하지 않습니다. 스트립은 동시에 양쪽 눈의 아래쪽 눈꺼풀 여백의 아래쪽 관자놀이 절반 위에 위치합니다. 연구 참여자는 눈을 감으라는 요청을 받게 됩니다. 과도한 자극 징후가 있으면 기록됩니다. 각 스트립의 습윤 정도는 테스트 5분 후에 기록됩니다. 스트립을 수집하여 추가 분석이 있을 때까지 -80˚C에서 1.5ml 에펜도르프 튜브에 보관합니다.