Mikrobiom der Augenoberfläche bei Patienten mit trockenem Auge

Die Augenoberfläche ist die erste Verteidigungslinie des Auges, daher werden dort äußere Bedrohungen wahrgenommen und potenzielle Beleidigungen neutralisiert. Im Laufe der Evolution haben sich verschiedene Mikroben, insbesondere Bakterien, als Kommensalen auf der Augenoberfläche angesiedelt. Die Kommensalen spielen eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Augenoberfläche. 1 Die angeborene Immunität der Augenoberfläche ist sehr aktiv und besteht aus aktiven Mechanismen zur Unterdrückung von Entzündungen. 2. Beispielsweise existieren Makrophagen, dendritische Zellen, Suppressorzellen, regulatorische Zellen, B-Zellen, IgA, Lysozym, antimikrobielle Peptide und Barrieren gegen externe Agenten. Die normalen Kommensalen der Augenoberfläche halten ein Grundniveau der Aktivierung der angeborenen Abwehr aufrecht, indem sie die Mustererkennungsrezeptoren auf den Epithelzellen der Augenoberfläche stimulieren. Diese normale Zusammensetzung von Mikroben ist wichtig, da es zu Entzündungen und Infektionen kommt, wenn ein pathogener Stamm eingeführt wird, der die Flora überwindet, oder wenn ein dominanter Stamm übermäßig immunogene Produkte absondert, wie das Exotoxin A von Staphylococcus, das marginale Keratitis, eine Form, auslöst von Typ-IV-Überempfindlichkeit. Die Floralast des Mikrobioms könnte auch die Tränenfunktion beeinflussen, da festgestellt wurde, dass eine höhere Floralast mit einem erhöhten Mucinabbau 3 und einer verringerten Globet-Zelldichte 4 verbunden ist. Frühere Studien [ich bin mir nicht sicher, welche Studien das sind] bei SERI/SNEC ebenfalls weisen auf die Bedeutung von Mikroben hin. Zum Beispiel gibt es bei Patienten mit trockenem Auge erhöhte Lysophospholipide in der Träne, und dies kann zu Entzündungsmediatoren wie Arachidonsäure und anderen Metaboliten beitragen. Die Lysophospholipide werden durch Phospholipase-A2-Reaktionen gebildet, und letztere können mikrobiellen Ursprungs sein. Da das Trockene Auge eine bekannte entzündliche Erkrankung der Augenoberfläche ist, können Mikroben auf diese Weise zur Pathologie beitragen.

Das Mikrobiom ist die Gesamtheit der an einer Körperstelle vorkommenden Mikroben. Im Auge kann das Mikrobiom aufgrund der zugänglichen Lage der Augenoberfläche nicht-invasiv untersucht werden. Trotz der Bedeutung des Mikrobioms der Augenoberfläche ist das Verständnis dieses Themas sehr oberflächlich und basiert weitgehend auf Kulturmethoden5-10. Dies kann irreführend sein, da einige der Mikroben für routinemäßige Zellkulturen nicht so zugänglich sind und ihre Anwesenheit möglicherweise unentdeckt bleibt oder ihr Anteil unterschätzt wird 11. Die kürzlich entwickelte metagenomische Sequenzierung ist im Vergleich zu Kulturen von Vorteil, um einen unvoreingenommenen Blick auf das Mikrobiom zu erhalten11.

Drei frühere Studien haben die Mikrobiomprofile der Augenoberfläche mit metagenomischer Sequenzierung von 16s-rRNA evaluiert 4, 12 13. Unterschiede im Mikrobiom wurden zwischen Probanden mit trockenen Augen oder Blepharitis und gesunden Probanden beobachtet. Darüber hinaus wurde im Vergleich zu Ergebnissen, die auf Bakterienkulturen basieren, eine viel größere Diversität der Augenflora entdeckt.

Die Schule für Chemie- und Umweltwissenschaften an der Nanyang Technological University hat die Mikrobiome mit solchen Techniken bewertet. Die Grundlage dafür ist, dass prokaryotische Organismen einzigartige DNA-Signaturen haben, die typischerweise die Ursprungsart charakterisieren können, und die relative Prävalenz der Organismen verschiedener Arten aus der relativen Häufigkeit der unterschiedlichen nachgewiesenen DNA abgeleitet werden kann. Das globale Human Microbiome Project versucht, das Mikrobiom in verschiedenen Teilen des menschlichen Körpers zu verstehen. Dies wird am besten im Darm verstanden, aber Veröffentlichungen über die Augenoberfläche stehen noch aus.

Kürzlich haben unsere Mitarbeiter herausgefunden, dass 3 Bakterien die Augenoberfläche des Auges dominieren. Dies sind Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans und Lactobacillus rhamnosus. Diese Dominanz von 3 Arten von Bakterien war unerwartet, da die vorherrschende Sicht auf die Kommensalen der Augenoberfläche darin besteht, dass koagulasenegative Staphylococcus dominiert, gefolgt von Staphylococcus aureus und Streptococcus mit weniger gramnegativen Bakterien und einigen Propionibacter spp 11. Unter den 3 Arten ist die Klebsiella-Pneumonie ein bekannter gramnegativer Erreger, der infektiöse Keratitis und in einigen Fällen Endophthalmitis verursachen kann. Die Rollen von Pseudoalteromonas und Lactobacillus sind völlig unbekannt. Ersteres ist ein nicht pathogenes, frei lebendes, gramnegatives Bakterium, von dem bekannt ist, dass es in marinen Umgebungen vorhanden ist. Überraschenderweise sind die hohen Konzentrationen der 3 vorherrschenden Bakterien bei den 3 menschlichen Teilnehmern relativ konstant, was auf ein gewisses Maß an Einheitlichkeit bei der Besiedlung der Augenoberfläche durch wichtige Bakterienmikroben bei nicht erkrankten Personen hindeutet.

Das Mikrobiom der Augenoberfläche kann durch steriles Austauschen des unteren Bindehautgewölbes mit anschließender Homogenisierung und Extraktion von DNA untersucht werden. Das Vorhandensein von Bakterien-DNA sagt nichts über die Funktion der Mikroben aus, da selbst tote und sich nicht vermehrende Organismen Rest-DNA haben. Die Technik des Sammelns von Proben kann auch RNA liefern, und durch reverse Transkriptions-PCR ist es möglich, das Vorhandensein spezifischer mikrobieller Transkripte zu bestimmen, die auf der Augenoberfläche gefunden werden. Darüber hinaus haben unsere Mitarbeiter von der Nanyang Polytechnic Pionierarbeit bei MALDI-TOF-Massenspektrometrietechniken geleistet, die die Charakterisierung bakterieller Proteome auf der Grundlage der Identifizierung einzigartiger bakterieller Peptidsequenzen ermöglichen. Zusammen ermöglichen diese Techniken der Bakterientranskript- und Proteinuntersuchungen die Bewertung der Genexpression und bis zu einem gewissen Grad des funktionellen Status der entdeckten Bakterien. Dies wäre im Fall von Mikroben, die zuvor noch nicht auf der Augenoberfläche entdeckt wurden, äußerst wichtig.

Abgesehen von dem offensichtlichen akademischen und wissenschaftlichen Fortschritt hat dieses Projekt auch medizinische Implikationen und potenziell neues geistiges Eigentum für kommerzielle Anwendungen. Erstens ist das Verständnis des Mikrobioms der erste Schritt zur Behandlung bestimmter Arten von Krankheiten wie marginaler Keratitis und ungewöhnlicher infektiöser Keratitis. Es legt nahe, wie das Immunsystem für die Behandlung manipuliert werden kann. Zweitens kann die Prävention von Krankheiten und Entzündungen durch die probiotische Verabreichung von lebenden Mikroben zur Kolonisierung der Augenoberfläche erreicht werden. Drittens kann die Studie zu neuen Techniken und Assays führen, die Mikroben und ihre Bestandteile identifizieren, die zu klinischen diagnostischen Assays entwickelt werden können.

Wir haben einige Industriepartner, die daran interessiert sind, mit uns zusammenzuarbeiten, um einige dieser Ideen zu entwickeln.

1. ZIELE

Wir wollen eine explorative Studie durchführen, um:

1. Bestimmen Sie die Zusammensetzung des bakteriellen Mikrobioms der menschlichen Augenoberfläche bei normalen Probanden und Patienten mit trockenem Auge
2. Bestimmen Sie die bakterielle Genexpression (bakterielle Transkripte) auf der menschlichen Augenoberfläche.
3. Charakterisieren Sie jedes Merkmal des Mikrobioms, das mit klinischen Merkmalen wie Alter, Status des Tränenfilms, Dysfunktion der Meibom-Drüsen, Exposition gegenüber Umweltstimulationen wie Rauchen usw. in Verbindung gebracht werden kann.

2. ERWARTETE RISIKEN UND NUTZEN Erwartete Risiken Für diese Studie werden keine potenziellen Probleme erwartet. Während der Entnahme des Mikrobioms aus dem unteren Bindehautgewölbe treten jedoch leichte Beschwerden auf. Dem Patienten wird nicht konservierendes Tetracain verabreicht, um Beschwerden zu minimieren. Es wird auch während des Schimers I-Tests ein leichtes Unbehagen geben.

Mögliche Vorteile Mit einem besseren Verständnis des Vorhandenseins verschiedener Mikrobiome auf der Augenoberfläche können wir weitere Einblicke in den komplexen Prozess gewinnen, der stattfindet.

3. STUDIENPOPULATION 3.1. Geben Sie die Anzahl und Art der einzuschreibenden Fächer an. 90 Probanden werden aus der SNEC-Klinik für trockene Augen und der allgemeinen Klinik rekrutiert, die vom Hauptprüfarzt betreut werden. 45 Probanden ohne Symptome des trockenen Auges werden als normale Kontrollen rekrutiert und 45 Probanden mit symptomatischem trockenem Auge werden als Probanden des trockenen Auges rekrutiert.

3.2. Kriterien für die Rekrutierung und den Rekrutierungsprozess

1. Rekrutierung normaler Kontrollpersonen – Alle 8 Fragen zu den Symptomen des trockenen Auges müssen während der Vorscreening-Phase frei von Symptomen des trockenen Auges sein. (Anhang 1) Fragebogen modifiziert nach Schein et al.,1997. Zur Rekrutierung von Probanden mit trockenem Auge: Mindestens eine der 8 Fragen zu Symptomen des trockenen Auges muss ≥ Grad 3 sein
2. Die Probanden erfüllen alle unten aufgeführten Einschlusskriterien.
3. Frei von Ausschlusskriterien. Die Erlaubnis würde von den behandelnden Ärzten eingeholt, bevor Probanden rekrutiert werden. Berechtigte Fächer werden vom Studienkoordinator zum Studium beraten. Bei Interesse des Faches begleitet die Studienkoordinatorin das Fach anschliessend bis zum SBFI Level 5 für die entsprechenden Assessments. Von allen Teilnehmern wird eine schriftliche Zustimmung nach Aufklärung eingeholt.

3.3. Einschlusskriterien

Der Proband muss alle Einschlusskriterien erfüllen, um an dieser Studie teilnehmen zu können.

1. Die Probanden müssen 21 Jahre oder älter sein
2. Bereit, alle Augenuntersuchungen in dieser Studie durchzuführen

3.4. Ausschlusskriterien

Alle Probanden, die zu Studienbeginn eines der Ausschlusskriterien erfüllen, werden von der Teilnahme ausgeschlossen.

1. Bekannte Vorgeschichte von Schilddrüsenerkrankungen (vom Arzt diagnostiziert).
2. Bekannte Vorgeschichte von Sjögren-Syndrom oder rheumatoider Arthritis (vom Arzt diagnostiziert).
3. Keine Augenoperation innerhalb der letzten 3 Monate und LASIK innerhalb eines Jahres.
4. Erkrankungen der Augenoberfläche wie Pterygium oder offensichtliche Lid-/Augenhöhlenerkrankungen mit Lagophthalmus.
5. Jeder andere spezifizierte Grund, wie vom klinischen Prüfarzt festgestellt.

4. STUDIENDESIGN UND VERFAHREN/METHODE

Studiendesign:

Beobachtungs-Querschnittsstudie

Anzahl Besuche:

Es wird nur 1 Besuch in dieser Studie geben.

Studiendauer:

1 Jahr

Verfahren:

Erhebung der Krankengeschichte und des Fragebogens zum Trockenen Auge Es wird einige Fragebögen geben, die aus der Krankengeschichte und einem Standardsatz von Fragebögen zum Trockenen Auge bestehen, die Faktoren wie Kontaktlinsengebrauch, Rauchen, Beruf usw. identifizieren.

Nicht-invasive Tränenbruchzeit (OCULUS K5M) Die nicht-invasive Tränenbruchzeit wird nicht-invasiv und vollautomatisch mit OCULUS K5M gemessen. Die neue Infrarotbeleuchtung ist für das menschliche Auge nicht sichtbar. Dadurch wird eine Blendung während der Untersuchung verhindert. Der Patient sitzt bequem vor dem Instrument und blinzelt frei, während er ein Ziel direkt vor sich fixiert. Sobald der Teilnehmer bereit ist, wird er angewiesen, zweimal zu blinzeln und nicht zu blinzeln. Der Keratograph 5M ist vollautomatisch und erfasst jede Unterbrechung oder Verzerrung im Bild, und der Zeitpunkt der Unterbrechung wird notiert. Für jedes Auge werden drei Messungen durchgeführt, um den Durchschnittswert zu erhalten.

Bindehautrötung (OCULUS K5M) Die Bindehautrötung wird mit OCULUS K5M beurteilt. Der Patient sitzt bequem vor dem Instrument und fixiert ein Ziel direkt vor ihm. Es wird ein Bild aufgenommen und eine Übersichtsanzeige der Bindehautrötung wird mit der "JENVIS Grading Scale" bewertet. JENVIS-Skalenbereich von 0 bis 4.

Rötewert Definition 0 Keine Befunde, z. Babys oder Kleinkinder

1. Einzelinjektionen, Richtwert für Erwachsene
2. Milde diffuse Injektionen
3. Schwere lokale Injektionen
4. Schwere diffuse Injektionen

Entnahme des Mikrobioms Zwei Mikrobiomproben werden von beiden Augen entnommen. Erstens: Ein Tropfen nicht konserviertes Tetracain wird in das Bindehautgewölbe eingeträufelt. Nachdem das stechende Gefühl abgeklungen ist, werden die Mikroben mit einem sterilen Wattestäbchen durch sanftes Rollen (bis zu 8 Hübe) aus dem unteren Bindehautgewölbe gesammelt. Der Vorgang wird dann für das andere Auge wiederholt.

Diese Swaps werden dann in DNA/RNA Shield (Zymo)-Reagenz eingeweicht und sofort 1 Minute lang homogenisiert, nach 30 Sekunden angehalten und 1 Minute lang auf Eis gehalten und weitere 30 Sekunden lang homogenisiert. Homogenisierte Proben werden bei 4°C gelagert. Dies gewährleistet eine für unseren Zweck optimale und ausreichende DNA/RNA-Ausbeute. Anschließende Nukleinsäureextraktion, PCR, Sequenzierung und bioinformatische Verfahren werden von unseren Mitarbeitern durchgeführt.

Lagerung: soll innerhalb eines Jahres analysiert werden, nicht länger als 5 Jahre.

Hornhaut-Fluorescein-Färbung (OCULUS K5M) Ein Tropfen normale Kochsalzlösung wird auf den Fluorescein-Streifen (Fluorets) geträufelt und dann abgeschüttelt, so dass kein sichtbarer Tropfen zurückbleibt. Die Person wird gebeten, vor dem Einführen des Fluoret in das untere Bindehautgewölbe am rechten und dann am linken Auge nach oben zu schauen. Die Hornhaut-Fluorescein-Färbung wird mit dem Keratograph 5M abgebildet. Das Bewertungssystem basiert auf CCLRU. Kurz gesagt gibt es 5 Hornhautzonen. Die Färbeskala ist 0–4, mit 0,5 Einheitsschritten in jeder der Zonen. Abschließend wird ein Bild der mit Fluorescein gefärbten Hornhaut gemacht.

Schirmers-I-Test Dies wird mit den derzeit bei SERI verwendeten Standardstreifen (5 mm breit mit einer Kerbe zum Falten) durchgeführt (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Es wird keine vorherige Anästhesie verwendet. Die Streifen werden in beiden Augen gleichzeitig über der unteren temporalen Hälfte des unteren Lidrandes positioniert. Der Studienteilnehmer wird gebeten, die Augen zu schließen. Alle übermäßigen Reizungszeichen werden notiert. Das Ausmaß der Benetzung in jedem Streifen wird nach 5 Minuten Testzeit aufgezeichnet. Der Streifen wird gesammelt und bis zur weiteren Analyse in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen bei -80 °C gelagert.