Microbioma da Superfície Ocular em Pacientes com Olho Seco

A superfície ocular é a primeira linha de defesa do olho, portanto, é onde as ameaças externas são detectadas e os insultos potenciais neutralizados. Ao longo da evolução, vários micróbios, especialmente bactérias, passaram a colonizar a superfície ocular como comensais. Os comensais têm o papel de manter a homeostase da superfície ocular. 1 A imunidade inata da superfície ocular é muito ativa e consiste em mecanismos ativos para suprimir a inflamação 2. Por exemplo, existem macrófagos, células dendríticas, células supressoras, células reguladoras, células B, IgA, lisozima, peptídeos antimicrobianos e barreiras contra agentes externos. Os comensais normais da superfície ocular mantêm um nível basal de ativação da defesa inata, estimulando os receptores de reconhecimento de padrões nas células epiteliais da superfície ocular. Essa composição normal de micróbios é importante, pois haverá inflamação e infecção se houver introdução de uma cepa patogênica que supera a flora, ou se uma cepa dominante secretar produtos excessivamente imunogênicos, como a exotoxina A de Staphylococcus, que desencadeia ceratite marginal, uma forma de hipersensibilidade tipo IV. A carga de flora do microbioma também pode influenciar a função lacrimal, pois uma carga de flora mais alta foi associada ao aumento da degradação de mucina 3 e redução da densidade de células globulares 4. Estudos anteriores [não tenho certeza de quais estudos são] no SERI/SNEC também destacam a importância dos micróbios. Por exemplo, em pacientes com olho seco, há aumento de lisofosfolipídios na lágrima, e isso pode contribuir para mediadores inflamatórios, como ácido araquidônico e outros metabólitos. Os lisofosfolípidos são formados por reações da fosfolipase A2, podendo esta última ser de origem microbiana. Como o olho seco é uma doença inflamatória conhecida da superfície ocular, essa é uma maneira pela qual os micróbios podem contribuir para a patologia.

O microbioma é a soma total do micróbio encontrado em um local do corpo. No olho, o microbioma pode ser investigado de forma não invasiva devido à localização acessível da superfície ocular. Apesar da importância do microbioma da superfície ocular, a compreensão deste tópico é muito superficial e amplamente baseada em métodos de cultura5-10. Isso pode ser enganoso porque alguns dos micróbios não são tão receptivos a culturas celulares de rotina e sua presença pode não ser detectada ou sua representação subestimada 11. O sequenciamento de metagenômica desenvolvido recentemente, em comparação com as culturas, é vantajoso para obter uma visão imparcial do microbioma11.

Três estudos anteriores avaliaram os perfis do microbioma da superfície ocular com sequenciamento metagenômico de 16s rRNA 4, 12 13. Diferenças no microbioma foram observadas entre indivíduos com olhos secos ou blefarite e indivíduos saudáveis. Além disso, uma diversidade muito maior de flora ocular foi descoberta em comparação com resultados baseados em cultura bacteriana.

A escola de ciências químicas e ambientais da Universidade Tecnológica de Nanyang avaliou os microbiomas usando essas técnicas. A base disso é que os organismos procarióticos têm assinaturas de DNA únicas que podem tipicamente caracterizar as espécies de origem, e a prevalência relativa dos organismos de diferentes espécies pode ser deduzida da abundância relativa dos diferentes DNAs detectados. O projeto global do microbioma humano busca entender o microbioma em diferentes partes do corpo humano. Isso é melhor compreendido no intestino, mas ainda não surgiram publicações na superfície ocular.

Recentemente, nossos colaboradores descobriram que 3 bactérias dominavam a superfície ocular do olho. Estes são Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans e Lactobacillus rhamnosus. Esta dominância de 3 tipos de bactérias foi inesperada, uma vez que a visão dominante dos comensais da superfície ocular é que o Staphylococcus coagulase negativo domina, seguido pelo Staphylococcus aureus e Streptococcus, com menos bactérias gram negativas, e alguns Propionibacter spp 11. Entre as 3 espécies, Klebsiella pneumonia é um patógeno gram negativo conhecido que pode causar ceratite infecciosa e, em alguns casos, endoftalmite. Os papéis de Pseudoalteromonas e Lactobacillus são totalmente desconhecidos. A primeira é uma bactéria gram negativa não patogênica de vida livre conhecida por estar presente em ambientes marinhos. Surpreendentemente, os altos níveis das 3 bactérias predominantes são relativamente constantes entre os 3 participantes humanos, sugerindo uma certa uniformidade na colonização da superfície ocular pelos principais micróbios bacterianos em indivíduos não doentes.

O microbioma da superfície ocular pode ser estudado por troca estéril do fórnice inferior da conjuntiva, seguida de homogeneização e extração de DNA. A presença de DNA de bactérias não informa sobre a função dos micróbios, pois mesmo organismos mortos e não proliferantes possuem DNA remanescente. A técnica de coleta de amostras também pode produzir RNA e, a partir da PCR de transcrição reversa, é possível determinar a presença de transcritos microbianos específicos que são encontrados na superfície ocular. Além disso, nossos colaboradores da Nanyang Polytechnic foram pioneiros em técnicas de espectrometria de massa MALDI TOF que permitem a caracterização de proteomas bacterianos, com base na identificação de sequências únicas de peptídeos bacterianos. Juntas, essas técnicas de transcrição de bactérias e investigações de proteínas permitem a avaliação da expressão gênica e, até certo ponto, o estado funcional das bactérias descobertas. Isso seria extremamente importante no caso de micróbios que não foram descobertos anteriormente na superfície ocular.

Além do óbvio avanço acadêmico e científico, este projeto também tem implicações médicas e potencial de novas propriedades intelectuais para aplicações comerciais. Em primeiro lugar, a compreensão do microbioma é o primeiro passo para tratar certos tipos de doenças, como ceratite marginal e ceratite infecciosa incomum. Ele sugere como o sistema imunológico pode ser manipulado para o tratamento. Em segundo lugar, a prevenção de doenças e inflamações pode ser alcançada pela administração probiótica de micróbios vivos para colonizar a superfície ocular. Em terceiro lugar, o estudo pode levar a novas técnicas e ensaios que identificam micróbios e seus componentes que podem ser desenvolvidos em ensaios de diagnóstico clínico.

Temos alguns colaboradores da indústria interessados ​​em fazer parceria conosco para desenvolver algumas dessas ideias.

1. OBJETIVOS

Pretendemos realizar um estudo exploratório para:

1. Determinar a composição do microbioma bacteriano da superfície ocular humana em voluntários normais e pacientes com olho seco
2. Determine a expressão do gene bacteriano (transcritos bacterianos) encontrados na superfície ocular humana.
3. Caracterize qualquer característica do microbioma que possa estar ligada a características clínicas, como idade, estado do filme lacrimal, disfunção da glândula meibomiana, exposição a estímulos ambientais, como tabagismo, etc.

2. RISCOS E BENEFÍCIOS ESPERADOS Riscos esperados Nenhum problema potencial é esperado para este estudo. No entanto, haverá um leve desconforto durante a coleta do microbioma do fórnice conjuntival inferior. Tetracaína não conservante será dada ao paciente para minimizar qualquer desconforto. Haverá também um leve desconforto durante o teste de Schimers I.

Benefícios potenciais Com uma maior compreensão da presença de vários microbiomas na superfície ocular, podemos obter mais informações sobre o complexo processo que está ocorrendo.

3. POPULAÇÃO DE ESTUDO 3.1. Liste o número e a natureza das disciplinas a serem matriculadas. 90 indivíduos serão recrutados da clínica de olho seco SNEC e clínica geral atendida pelo Investigador Principal. 45 indivíduos sem sintomas de olho seco serão recrutados como controles normais e 45 indivíduos com olho seco sintomático serão recrutados como indivíduos com olho seco.

3.2. Critérios de Recrutamento e Processo de Recrutamento

1. Para recrutar controles normais - Todas as 8 perguntas sobre sintomas de olho seco devem estar livres de sintomas de olho seco durante o estágio de pré-triagem. (Apêndice 1) Questionário modificado após Schein et al.,1997. Para recrutar indivíduos com olho seco - Pelo menos uma das 8 perguntas sobre sintomas de olho seco deve ser ≥ grau 3
2. Os indivíduos atendem a todos os critérios de inclusão listados abaixo.
3. Livre de critérios de exclusão. A permissão seria solicitada aos médicos assistentes antes que os indivíduos fossem recrutados. Os indivíduos elegíveis serão aconselhados sobre o estudo pelo coordenador do estudo. Se houver interesse da disciplina, o coordenador do estudo acompanhará a disciplina até o nível 5 do SERI para as avaliações pertinentes. O consentimento informado por escrito será obtido de todos os participantes.

3.3. Critério de inclusão

O indivíduo deve atender a todos os critérios de inclusão para participar deste estudo.

1. Os indivíduos devem ter 21 anos ou mais
2. Disposto a realizar todos os exames oftalmológicos neste estudo

3.4. Critério de exclusão

Todos os indivíduos que atenderem a qualquer um dos critérios de exclusão na linha de base serão excluídos da participação.

1. História conhecida de distúrbios da tireoide (diagnosticada pelo médico).
2. História conhecida de síndrome de Sjogren ou artrite reumatoide (diagnosticada por médico).
3. Nenhuma cirurgia ocular nos últimos 3 meses e LASIK em 1 ano.
4. Doenças da superfície ocular, como pterígio, ou doença óbvia da pálpebra/orbitária com lagoftalmo.
5. Qualquer outro motivo especificado conforme determinado pelo investigador clínico.

4. DESENHO DO ESTUDO E PROCEDIMENTOS/METODOLOGIA

Design de estudo:

Observacional - Estudo transversal

Nº de visitas:

Haverá apenas 1 visita neste estudo.

Duração do estudo:

1 ano

Procedimentos:

Coleta de histórico médico e questionário de olho seco Haverá algum questionário que consiste em histórico médico e um conjunto padrão de questionários de olho seco que identificam fatores como uso de lentes de contato, tabagismo, ocupação e etc.

Tempo de rompimento de lacrimejamento não invasivo (OCULUS K5M) O tempo de rompimento de lacrimejamento não invasivo é medido de forma não invasiva e totalmente automática usando o OCULUS K5M. A nova iluminação infravermelha não é visível ao olho humano. Isso evita o ofuscamento durante o exame. O paciente se sentará confortavelmente em frente ao instrumento e piscará livremente enquanto se fixa em um alvo diretamente à frente. Assim que o participante estiver pronto, ele será instruído a piscar duas vezes e abster-se de piscar. O Keratograph 5M é totalmente automatizado e irá capturar qualquer quebra ou distorção na imagem e o tempo da quebra será anotado. Três leituras serão feitas para cada olho para obter o valor médio.

Vermelhidão da conjuntiva (OCULUS K5M) A vermelhidão da conjuntiva será avaliada usando OCULUS K5M. O paciente se sentará confortavelmente em frente ao instrumento enquanto se fixa em um alvo diretamente à frente. As imagens serão capturadas e uma visão geral da vermelhidão da conjuntiva será avaliada pela "Escala de classificação JENVIS". A escala JENVIS varia de 0 a 4.

Valor de vermelhidão Definição 0 Sem achados, ex. Bebês ou bebês

1. Injeções únicas, valor padrão para adultos
2. Injeções difusas leves
3. Injeções locais severas
4. Injeções difusas graves

Coleta de microbioma Dois espécimes de microbioma serão coletados de ambos os olhos. Primeiro: uma gota de tetracaína não preservada será instilada no fórnice conjuntival. Depois que a sensação de ardor for resolvida, um cotonete estéril será usado para coletar os micróbios do fórnice conjuntival inferior usando uma ação de rolamento suave (até 8 movimentos). O procedimento é então repetido para o olho oposto.

Essas trocas serão então embebidas no reagente DNA/RNA Shield (Zymo) e imediatamente homogeneizadas por 1 minuto, paradas em 30 segundos, mantidas no gelo por 1 minuto e homogeneizadas por mais 30 segundos. As amostras homogeneizadas serão armazenadas a 4°C. Isso garante um rendimento de DNA/RNA ideal e suficiente para o nosso propósito. Os procedimentos subsequentes de extração de ácidos nucleicos, PCR, sequenciamento e bioinformática serão realizados por nossos colaboradores.

Armazenamento: destinado a ser analisado dentro de um ano, não mais de 5 anos.

Coloração de fluoresceína da córnea (OCULUS K5M) Uma gota de solução salina normal será instilada na tira de fluoresceína (Fluorets) e então sacudida para que nenhuma gota visível permaneça. Pede-se ao sujeito que olhe para cima antes da introdução do fluoreto no fórnice conjuntival inferior do olho direito e depois do esquerdo. A coloração de fluoresceína da córnea será visualizada pelo Keratograph 5M. O sistema de pontuação será baseado no CCLRU. Resumidamente, haverá 5 zonas da córnea. A escala de coloração é 0-4, com 0,5 passos de unidade em cada uma das zonas. Por fim, será tirada uma foto da córnea manchada com fluoresceína.

Teste de Schirmers I Isso será feito com as tiras padrão usadas atualmente na SERI (5 mm de largura com um entalhe para dobrar) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, Reino Unido). Nenhum anestésico prévio será usado. As tiras serão posicionadas sobre a metade temporal inferior da margem palpebral inferior em ambos os olhos ao mesmo tempo. O participante do estudo será solicitado a fechar os olhos. Quaisquer sinais de irritação excessiva serão observados. A extensão do molhamento em cada tira será registrada após 5 minutos de teste. A tira será coletada e armazenada em tubos eppendorf de 1,5ml a -80˚C até análise posterior.