Microbioma della superficie oculare nei pazienti con occhio secco

La superficie oculare è la prima linea di difesa dell'occhio, è quindi qui che vengono percepite le minacce esterne e neutralizzati i potenziali insulti. Nel corso dell'evoluzione, vari microbi, soprattutto batteri, sono giunti a colonizzare la superficie oculare come commensali. I commensali hanno un ruolo nel mantenere l'omeostasi della superficie oculare. 1 L'immunità innata della superficie oculare è molto attiva e consiste in meccanismi attivi per sopprimere l'infiammazione 2. Ad esempio, esistono macrofagi, cellule dendritiche, cellule soppressori, cellule regolatrici, cellule B, IgA, lisozima, peptidi antimicrobici e barriere contro gli agenti esterni. I normali commensali della superficie oculare mantengono un livello basale di attivazione della difesa innata stimolando i recettori di riconoscimento del pattern sulle cellule epiteliali della superficie oculare. Questa normale composizione microbica è importante poiché si verificheranno infiammazione e infezione se si introduce un ceppo patogeno che supera la flora, o se un ceppo dominante secerne prodotti eccessivamente immunogenici, come l'esotossina A di Staphylococcus che scatena la cheratite marginale, una forma di ipersensibilità di tipo IV. Il carico di flora del microbioma potrebbe anche influenzare la funzione lacrimale in quanto è stato riscontrato che un carico di flora più elevato è associato a una maggiore degradazione della mucina 3 e a una ridotta densità delle cellule globose 4. Studi precedenti [non sono sicuro di quali studi si tratti] anche presso SERI / SNEC sottolineare l'importanza dei microbi. Ad esempio, nei pazienti con occhio secco, vi è un aumento dei lisofosfolipidi nella lacrima e ciò può contribuire a mediatori dell'infiammazione come l'acido arachidonico e altri metaboliti. I lisofosfolipidi sono formati dalle reazioni della fosfolipasi A2 e quest'ultima può essere di origine microbica. Poiché l'occhio secco è una nota malattia infiammatoria della superficie oculare, questo è un modo in cui i microbi possono contribuire alla patologia.

Il microbioma è la somma totale del microbo trovato in una posizione del corpo. Nell'occhio il microbioma può essere studiato in modo non invasivo a causa della posizione accessibile della superficie oculare. Nonostante l'importanza del microbioma della superficie oculare, la comprensione di questo argomento è molto superficiale e si basa in gran parte sui metodi di coltura5-10. Ciò può essere fuorviante perché alcuni dei microbi non sono così suscettibili alle colture cellulari di routine e la loro presenza potrebbe non essere rilevata o la loro rappresentazione sottovalutata 11. Il sequenziamento della metagenomica sviluppato di recente, rispetto alle colture, è vantaggioso per ottenere una visione imparziale del microbioma11.

Tre studi precedenti hanno valutato i profili del microbioma della superficie oculare con il sequenziamento metagenomico di 16s rRNA 4, 12 13. Sono state osservate differenze nel microbioma tra soggetti con secchezza oculare o blefarite e soggetti sani. Inoltre, è stata scoperta una diversità molto maggiore della flora oculare rispetto ai risultati basati sulla coltura batterica.

La scuola di scienze della vita chimica e ambientale della Nanyang Technological University ha valutato i microbiomi utilizzando tali tecniche. La base di ciò è che gli organismi procarioti hanno firme di DNA uniche che possono caratterizzare tipicamente le specie di origine e la prevalenza relativa degli organismi di specie diverse può essere dedotta dall'abbondanza relativa del diverso DNA rilevato. Il progetto globale sul microbioma umano cerca di comprendere il microbioma in diverse parti del corpo umano. Questo è meglio compreso nell'intestino, ma devono ancora emergere pubblicazioni sulla superficie oculare.

Recentemente i nostri collaboratori hanno scoperto che 3 batteri dominavano la superficie oculare dell'occhio. Questi sono Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans e Lactobacillus rhamnosus. Questa dominanza di 3 tipi di batteri era inaspettata, poiché l'opinione dominante dei commensali della superficie oculare è che domina lo Staphylococcus coagulasi-negativo, seguito da Staphylococcus aureus e Streptococcus, con meno batteri gram-negativi, e alcuni Propionibacter spp 11. Tra le 3 specie, Klebsiella pneumonia è un noto patogeno gram-negativo che può causare cheratite infettiva e, in alcuni casi, endoftalmite. I ruoli di Pseudoalteromonas e Lactobacillus sono del tutto sconosciuti. Il primo è un batterio gram-negativo a vita libera non patogeno noto per essere presente in ambienti marini. Sorprendentemente gli alti livelli dei 3 batteri predominanti sono relativamente costanti tra i 3 partecipanti umani, suggerendo una certa uniformità nella colonizzazione della superficie oculare da parte dei principali microbi batterici in individui non malati.

Il microbioma della superficie oculare può essere studiato mediante scambio sterile del fornice inferiore della congiuntiva seguito da omogeneizzazione ed estrazione del DNA. La presenza di DNA batterico non informa sulla funzione dei microbi, poiché anche gli organismi morti e non proliferanti hanno DNA residuo. La tecnica di raccolta dei campioni può anche produrre RNA e dalla PCR di trascrizione inversa è possibile determinare la presenza di specifici trascritti microbici che si trovano nella superficie oculare. Inoltre, i nostri collaboratori del Politecnico di Nanyang sono stati i pionieri delle tecniche di spettrometria di massa MALDI TOF che consentono la caratterizzazione dei proteomi batterici, basata sull'identificazione di sequenze uniche di peptidi batterici. Insieme, queste tecniche di trascrizione batterica e indagini proteiche consentono la valutazione dell'espressione genica e, in una certa misura, dello stato funzionale dei batteri scoperti. Questo sarebbe estremamente importante nel caso di microbi che non sono stati precedentemente scoperti sulla superficie oculare.

Oltre all'ovvio progresso accademico e scientifico, questo progetto ha anche implicazioni mediche e potenziali nuove proprietà intellettuali per applicazioni commerciali. In primo luogo, la comprensione del microbioma è il primo passo per trattare alcuni tipi di malattie come la cheratite marginale e la cheratite infettiva insolita. Suggerisce come il sistema immunitario può essere manipolato per il trattamento. In secondo luogo, la prevenzione delle malattie e dell'infiammazione può essere ottenuta mediante la somministrazione di probiotici di microbi viventi per colonizzare la superficie oculare. In terzo luogo, lo studio può portare a nuove tecniche e analisi che identificano i microbi ei loro componenti che possono essere sviluppate in analisi diagnostiche cliniche.

Abbiamo alcuni collaboratori del settore che sono interessati a collaborare con noi per sviluppare alcune di queste idee.

1. OBIETTIVI

Ci proponiamo di condurre uno studio esplorativo per:

1. Determinare la composizione del microbioma batterico della superficie oculare umana in volontari normali e pazienti con occhio secco
2. Determinare l'espressione genica batterica (trascrizioni batteriche) trovata nella superficie oculare umana.
3. Caratterizzare qualsiasi caratteristica del microbioma che possa essere collegata a caratteristiche cliniche come l'età, lo stato del film lacrimale, la disfunzione della ghiandola di Meibomio, l'esposizione a stimoli ambientali come il fumo, ecc.

2. RISCHI E BENEFICI PREVISTI Rischi previsti Non sono previsti potenziali problemi per questo studio. Tuttavia, ci sarà un leggero disagio durante la raccolta del microbioma dal fornice congiuntivale inferiore. Al paziente verrà somministrata tetracaina senza conservanti per ridurre al minimo qualsiasi disagio. Ci sarà anche un leggero disagio durante lo Schimers I test.

Potenziali vantaggi Con una maggiore comprensione della presenza di vari microbiomi nella superficie oculare, possiamo ottenere ulteriori informazioni sul complesso processo in atto.

3. POPOLAZIONE IN STUDIO 3.1. Elencare il numero e la natura dei soggetti da iscrivere. 90 soggetti saranno reclutati dalla clinica SNEC per l'occhio secco e dalla clinica generale assistita dal Principal Investigator. 45 soggetti senza sintomi di secchezza oculare saranno reclutati come controlli normali e 45 soggetti con secchezza oculare sintomatica saranno reclutati come soggetti con secchezza oculare.

3.2. Criteri per il reclutamento e il processo di reclutamento

1. Per reclutare controlli normali- Tutte le 8 domande sui sintomi dell'occhio secco devono essere prive di sintomi dell'occhio secco durante la fase di pre-screening. (Appendice 1) Questionario modificato dopo Schein et al.,1997. Per reclutare soggetti con secchezza oculare: almeno una delle 8 domande sui sintomi dell'occhio secco deve essere di grado ≥ 3
2. I soggetti soddisfano tutti i criteri di inclusione elencati di seguito.
3. Privo di criteri di esclusione. Il permesso sarebbe richiesto ai medici curanti prima che i soggetti vengano reclutati. I soggetti idonei saranno consigliati sullo studio dal coordinatore dello studio. Se il soggetto è interessato, il coordinatore dello studio accompagnerà poi il soggetto al livello 5 SEFRI per le relative valutazioni. Il consenso informato scritto sarà ottenuto da tutti i partecipanti.

3.3. Criterio di inclusione

Il soggetto deve soddisfare tutti i criteri di inclusione per partecipare a questo studio.

1. I soggetti devono avere almeno 21 anni
2. Disposto a eseguire tutti gli esami oculistici in questo studio

3.4. Criteri di esclusione

Tutti i soggetti che soddisfano uno qualsiasi dei criteri di esclusione al basale saranno esclusi dalla partecipazione.

1. Storia nota di disturbi della tiroide (diagnosticati dal medico).
2. Storia nota di sindrome di Sjogren o artrite reumatoide (diagnosticata dal medico).
3. Nessun intervento chirurgico oculare negli ultimi 3 mesi e LASIK entro 1 anno.
4. Malattie della superficie oculare come il pterigio o evidente malattia palpebrale/orbitale con lagoftalmo.
5. Qualsiasi altra ragione specificata determinata dallo sperimentatore clinico.

4. DISEGNO E PROCEDURE/METODOLOGIA DELLO STUDIO

Disegno dello studio:

Osservazionale - Studio trasversale

N. di visite:

Ci sarà solo 1 visita in questo studio.

Durata dello studio:

1 anno

Procedure:

Raccolta di anamnesi e questionari sull'occhio secco Ci saranno alcuni questionari che consistono in anamnesi e una serie standard di questionari sull'occhio secco che identificano fattori come l'uso di lenti a contatto, il fumo, l'occupazione e così via.

Tempo di rottura lacrimale non invasivo (OCULUS K5M) Il tempo di rottura lacrimale non invasivo viene misurato in modo non invasivo e completamente automatico utilizzando OCULUS K5M. La nuova illuminazione a infrarossi non è visibile all'occhio umano. Ciò impedisce l'abbagliamento durante l'esame. Il paziente si siederà comodamente davanti allo strumento e sbatterà le palpebre liberamente mentre si fissa su un bersaglio direttamente davanti. Una volta che il partecipante è pronto, gli verrà chiesto di battere le palpebre due volte e di astenersi dal battere le palpebre. Keratograph 5M è completamente automatizzato e catturerà qualsiasi interruzione o distorsione nell'immagine e verrà annotata l'ora dell'interruzione. Saranno prese tre letture per ciascun occhio per ottenere il valore medio.

Arrossamento della congiuntiva (OCULUS K5M) L'arrossamento della congiuntiva sarà valutato utilizzando OCULUS K5M. Il paziente si siederà comodamente davanti allo strumento mentre si fissa su un bersaglio direttamente davanti. L'immagine verrà catturata e una visualizzazione panoramica del rossore della congiuntiva sarà valutata dalla "Scala di classificazione JENVIS". Scala JENVIS da 0 a 4.

Valore rossore Definizione 0 Nessun risultato, ad es. Neonati o neonati

1. Iniezioni singole, valore standard per gli adulti
2. Iniezioni diffuse lievi
3. Iniezioni locali gravi
4. Iniezioni diffuse gravi

Raccolta del microbioma Verranno raccolti due campioni di microbioma da entrambi gli occhi. Primo: una goccia di tetracaina senza conservanti verrà instillata nel fornice congiuntivale. Dopo che la sensazione di bruciore si è risolta, verrà utilizzato uno scambio di cotone sterile per raccogliere i microbi dal fornice congiuntivale inferiore utilizzando una delicata azione di rotolamento (fino a 8 colpi). La procedura viene quindi ripetuta per l'occhio opposto.

Questi scambi verranno quindi immersi nel reagente DNA/RNA Shield (Zymo) e immediatamente omogeneizzati per 1 minuto, fermati a 30 secondi e tenuti in ghiaccio per 1 minuto e omogeneizzati per altri 30 secondi. I campioni omogeneizzati saranno conservati a 4°C. Ciò garantisce una resa ottimale e sufficiente di DNA/RNA per il nostro scopo. Le successive procedure di estrazione dell'acido nucleico, PCR, sequenziamento e bioinformatica saranno eseguite dai nostri collaboratori.

Stoccaggio: destinato ad essere analizzato entro un anno, non più di 5 anni.

Colorazione corneale con fluoresceina (OCULUS K5M) Una goccia di soluzione fisiologica verrà instillata sulla striscia di fluoresceina (Fluorets) e poi scrollata di dosso in modo che non rimanga alcuna goccia visibile. Al soggetto viene chiesto di alzare lo sguardo prima dell'introduzione del fluorescenza al fornice congiuntivale inferiore sull'occhio destro e poi sinistro. La colorazione corneale con fluoresceina sarà ripresa da Keratograph 5M. Il sistema di punteggio sarà basato su CCLRU. In breve, ci saranno 5 zone corneali. La scala di colorazione è 0-4, con passi di 0,5 unità in ciascuna delle zone. Infine, verrà scattata una foto della cornea colorata con fluoresceina.

Test di Schirmer I Questo verrà eseguito con le strisce standard attualmente utilizzate presso la SERI (larghezza 5 mm con una tacca per la piegatura) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Non verrà utilizzato alcun anestetico precedente. Le strisce saranno posizionate sopra la metà temporale inferiore del margine palpebrale inferiore in entrambi gli occhi contemporaneamente. Al partecipante allo studio verrà chiesto di chiudere gli occhi. Si noteranno eventuali segni di eccessiva irritazione. L'entità della bagnatura in ciascuna striscia verrà registrata dopo 5 minuti di test. La striscia verrà raccolta e conservata in provette eppendorf da 1,5 ml a -80°C fino a ulteriore analisi.