Микробиом поверхности глаза у пациентов с синдромом сухого глаза

Глазная поверхность является первой линией защиты глаза, поэтому она воспринимает внешние угрозы и нейтрализует потенциальные повреждения. В ходе эволюции различные микробы, особенно бактерии, стали колонизировать глазную поверхность в качестве комменсалов. Комменсалы играют роль в поддержании гомеостаза глазной поверхности. 1 Врожденный иммунитет поверхности глаза очень активен и состоит из активных механизмов подавления воспаления 2. Например, существуют макрофаги, дендритные клетки, клетки-супрессоры, регуляторные клетки, В-клетки, IgA, лизоцим, антимикробные пептиды и барьеры против внешних агентов. Нормальные комменсалы поверхности глаза поддерживают базовый уровень активации врожденной защиты, стимулируя рецепторы распознавания образов на эпителиальных клетках поверхности глаза. Этот нормальный состав микробов важен, так как воспаление и инфекция возникают, если происходит внедрение патогенного штамма, который побеждает флору, или если доминирующий штамм секретирует чрезмерно иммуногенные продукты, такие как экзотоксин А стафилококка, который вызывает краевой кератит, форму гиперчувствительности IV типа. Нагрузка микробиома флорой также может влиять на функцию слезы, поскольку было обнаружено, что более высокая нагрузка флоры связана с усилением деградации муцина 3 и снижением плотности клеток глазного яблока 4. Предыдущие исследования [я не уверен, какие это исследования] в SERI / SNEC также указывают на важность микробов. Например, у пациентов с синдромом сухого глаза в слезе повышено содержание лизофосфолипидов, что может способствовать появлению медиаторов воспаления, таких как арахидоновая кислота и другие метаболиты. Лизофосфолипиды образуются в результате реакций фосфолипазы А2, и последние могут иметь микробное происхождение. Поскольку сухость глаз является известным воспалительным заболеванием глазной поверхности, это один из способов, которым микробы могут способствовать патологии.

Микробиом представляет собой совокупность микробов, обнаруженных в определенном месте тела. В глазу микробиом можно исследовать неинвазивно благодаря доступному расположению поверхности глаза. Несмотря на важность микробиома поверхности глаза, понимание этой темы очень поверхностно и в значительной степени основано на культуральных методах5-10. Это может ввести в заблуждение, потому что некоторые из микробов не так хорошо поддаются рутинному культивированию клеток, и их присутствие может остаться незамеченным или их представленность недооценена 11. Недавно разработанное метагеномное секвенирование по сравнению с культурами выгодно для получения непредвзятого представления о микробиоме11.

В трех предыдущих исследованиях оценивали профили микробиома поверхности глаза с помощью метагеномного секвенирования 16s рРНК 4, 12, 13. Различия в микробиоме наблюдались между субъектами с сухостью глаз или блефаритом и здоровыми субъектами. Кроме того, было обнаружено гораздо большее разнообразие глазной флоры по сравнению с результатами, основанными на бактериальной культуре.

Школа химических и экологических наук о жизни в Наньянском технологическом университете оценила микробиомы с использованием таких методов. Основанием для этого является то, что прокариотические организмы имеют уникальные сигнатуры ДНК, которые обычно могут характеризовать виды происхождения, а относительную распространенность организмов разных видов можно вывести из относительного количества обнаруженных различных ДНК. Глобальный проект микробиома человека направлен на изучение микробиома в различных частях человеческого тела. Это лучше всего понятно в кишечнике, но публикации о поверхности глаза еще не появились.

Недавно наши сотрудники обнаружили, что на глазной поверхности глаза преобладают 3 бактерии. Это Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans и Lactobacillus rhamnosus. Это доминирование 3 типов бактерий было неожиданным, поскольку преобладающее мнение комменсалов глазной поверхности состоит в том, что доминирует коагулазоотрицательный стафилококк, за которым следуют золотистый стафилококк и стрептококк с меньшим количеством грамотрицательных бактерий и некоторые виды пропионибактерий 11. Среди трех видов Klebsiella pneumonia является известным грамотрицательным патогеном, который может вызывать инфекционный кератит, а в некоторых случаях и эндофтальмит. Роль Pseudoalteromonas и Lactobacillus совершенно неизвестна. Первые представляют собой непатогенные свободноживущие грамотрицательные бактерии, которые, как известно, присутствуют в морских условиях. Удивительно, но высокие уровни трех преобладающих бактерий относительно постоянны среди трех человек-участников, что свидетельствует об определенной степени единообразия в колонизации поверхности глаза основными бактериальными микробами у здоровых людей.

Микробиом поверхности глаза можно изучить путем стерильной замены нижнего свода конъюнктивы с последующей гомогенизацией и выделением ДНК. Наличие ДНК бактерий не дает информации о функции микробов, поскольку даже мертвые и неразмножающиеся организмы имеют остатки ДНК. Техника сбора образцов также может дать РНК, а с помощью ПЦР с обратной транскрипцией можно определить наличие специфических микробных транскриптов, которые обнаруживаются на поверхности глаза. Кроме того, наши сотрудники из Nanyang Polytechnic впервые применили методы масс-спектрометрии MALDI TOF, которые позволяют охарактеризовать бактериальные протеомы на основе идентификации уникальных последовательностей бактериальных пептидов. Вместе эти методы исследования транскриптов бактерий и белков позволяют оценить экспрессию генов и, в некоторой степени, функциональное состояние обнаруженных бактерий. Это было бы чрезвычайно важно в случае микробов, которые ранее не были обнаружены на поверхности глаза.

Помимо очевидного академического и научного прогресса, этот проект также имеет медицинские последствия и потенциально новую интеллектуальную собственность для коммерческого применения. Во-первых, понимание микробиома — это первый шаг к лечению определенных типов заболеваний, таких как маргинальный кератит и необычный инфекционный кератит. Он предлагает, как можно манипулировать иммунной системой для лечения. Во-вторых, предотвращение заболеваний и воспалений может быть достигнуто введением пробиотиков живых микробов для колонизации поверхности глаза. В-третьих, исследование может привести к новым методам и анализам, которые идентифицируют микробы и их компоненты, которые могут быть преобразованы в клинические диагностические анализы.

У нас есть несколько отраслевых сотрудников, которые заинтересованы в сотрудничестве с нами для разработки некоторых из этих идей.

1. ЦЕЛИ

Мы стремимся провести предварительное исследование, чтобы:

1. Определить состав бактериального микробиома глазной поверхности человека у здоровых добровольцев и пациентов с синдромом сухого глаза
2. Определите экспрессию бактериального гена (бактериальные транскрипты), обнаруженную на поверхности глаза человека.
3. Охарактеризуйте любую особенность микробиома, которая может быть связана с клиническими характеристиками, такими как возраст, состояние слезной пленки, дисфункция мейбомиевых желез, воздействие стимуляции окружающей среды, такой как курение и т. д.

2. ОЖИДАЕМЫЕ РИСКИ И ПРЕИМУЩЕСТВА Ожидаемые риски По данному исследованию не ожидается никаких потенциальных проблем. Однако при сборе микробиома из нижнего конъюнктивального свода будет ощущаться небольшой дискомфорт. Пациенту будет дан тетракаин без консервантов, чтобы свести к минимуму любой дискомфорт. Также будет небольшой дискомфорт во время теста Шимерса I.

Потенциальные преимущества Благодаря более глубокому пониманию присутствия различных микробиомов на поверхности глаза мы можем получить более полное представление о происходящем сложном процессе.

3. ИССЛЕДУЕМОЕ НАСЕЛЕНИЕ 3.1. Перечислите количество и характер предметов, которые будут зачислены. 90 субъектов будут набраны из клиники синдрома сухого глаза SNEC и общей клиники, обслуживаемой главным исследователем. 45 субъектов без симптомов сухости глаз будут набраны в качестве обычных контролей, а 45 субъектов с симптомами сухости глаз будут набраны в качестве субъектов с синдромом сухого глаза.

3.2. Критерии найма и процесс найма

1. Чтобы набрать нормальные контроли - Все 8 вопросов о симптомах сухости глаз должны быть свободны от симптомов сухости глаз на этапе предварительного скрининга. (Приложение 1) Опросник изменен после Schein et al., 1997. Для набора субъектов с синдромом сухого глаза - по крайней мере, один из 8 вопросов о симптомах сухого глаза должен быть ≥ 3 степени.
2. Субъекты соответствуют всем критериям включения, перечисленным ниже.
3. Без критериев исключения. Перед набором испытуемых необходимо получить разрешение у лечащих врачей. Приемлемые субъекты будут консультированы по исследованию координатором исследования. Если субъект заинтересован, координатор исследования затем сопровождает субъекта до уровня 5 SERI для соответствующих оценок. Информированное письменное согласие будет получено от всех участников.

3.3. Критерии включения

Субъект должен соответствовать всем критериям включения для участия в этом исследовании.

1. Субъекты должны быть старше 21 года.
2. Готовы выполнить все проверки зрения в этом исследовании

3.4. Критерий исключения

Все субъекты, отвечающие любому из критериев исключения на исходном уровне, будут исключены из участия.

1. Заболевания щитовидной железы в анамнезе (диагностировано врачом).
2. Известная история синдрома Шегрена или ревматоидного артрита (диагноз поставлен врачом).
3. Никаких глазных операций в течение последних 3 месяцев и LASIK в течение 1 года.
4. Болезни глазной поверхности, такие как птеригиум, или явное заболевание век/орбиты с лагофтальмом.
5. Любая другая указанная причина, определенная клиническим исследователем.

4. ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ И ПРОЦЕДУРЫ/МЕТОДОЛОГИЯ

Дизайн исследования:

Наблюдательное исследование — поперечное сечение

Количество посещений:

В этом исследовании будет только 1 посещение.

Продолжительность обучения:

1 год

Процедуры:

Сбор анамнеза болезни и опросник по синдрому сухого глаза Будет анкета, состоящая из анамнеза болезни и стандартного набора опросников по синдрому сухого глаза, которые определяют такие факторы, как использование контактных линз, курение, профессия и т. д.

Неинвазивное время разрыва разрыва (OCULUS K5M) Неинвазивное время разрыва разрыва измеряется неинвазивным и полностью автоматическим способом с помощью OCULUS K5M. Новая инфракрасная подсветка не видна человеческому глазу. Это предотвращает появление бликов во время осмотра. Пациент удобно сядет перед прибором и будет свободно моргать, фиксируя цель прямо перед собой. Когда участник будет готов, ему будет предложено дважды моргнуть и не моргать. Кератограф 5М полностью автоматизирован, он зафиксирует любой разрыв или искажение изображения и зафиксирует время разрыва. Для каждого глаза будут сняты три показания, чтобы получить среднее значение.

Покраснение конъюнктивы (OCULUS K5M) Покраснение конъюнктивы будет оцениваться с помощью OCULUS K5M. Пациент будет удобно сидеть перед инструментом, фиксируя цель прямо перед собой. Будет получено изображение, и обзорное отображение покраснения конъюнктивы будет оценено по «Шкале оценок JENVIS». Диапазон шкалы JENVIS от 0 до 4.

Значение покраснения Определение 0 Нет данных, напр. Младенцы или младенцы

1. Разовые инъекции, стандартное значение для взрослых
2. Легкие диффузные инъекции
3. Сильные местные инъекции
4. Тяжелые диффузные инъекции

Сбор микробиома Два образца микробиома будут взяты из обоих глаз. Первый: в свод конъюнктивы закапывают каплю тетракаина без консерванта. После того, как ощущение жжения исчезнет, ​​стерильным ватным тампоном можно будет собрать микробы из нижнего конъюнктивального свода, используя мягкое перекатывающее действие (до 8 движений). Затем процедура повторяется для противоположного глаза.

Затем эти свопы пропитывают реагентом DNA/RNA Shield (Zymo) и немедленно гомогенизируют в течение 1 минуты, останавливают через 30 секунд, выдерживают на льду в течение 1 минуты и гомогенизируют еще в течение 30 секунд. Гомогенизированные образцы будут храниться при температуре 4°C. Это обеспечивает оптимальный и достаточный выход ДНК/РНК для нашей цели. Последующие процедуры экстракции нуклеиновых кислот, ПЦР, секвенирования и биоинформатики будут выполняться нашими сотрудниками.

Хранение: предназначено для анализа в течение года, не более 5 лет.

Окрашивание роговицы флуоресцеином (OCULUS K5M) На полоску с флуоресцеином (Fluorets) капают каплю физиологического раствора, затем стряхивают так, чтобы не осталось видимой капли. Субъекта просят посмотреть вверх перед введением флуореста в нижний свод конъюнктивы правого, а затем левого глаза. Окрашивание роговицы флуоресцеином будет отображаться на кератографе 5М. Система подсчета очков будет основана на CCLRU. Вкратце, будет 5 зон роговицы. Шкала окрашивания 0-4 с шагом 0,5 единицы в каждой из зон. Наконец, будет сделан снимок роговицы, окрашенной флуоресцеином.

Испытание Ширмера I Это будет сделано со стандартными полосками, которые в настоящее время используются в SERI (шириной 5 мм с выемкой для складывания) (тестовые полоски Ширмера на разрыв, Clement Clarke International, Великобритания). Предварительная анестезия не используется. Полоски будут располагаться над нижней височной половиной нижнего края нижнего века обоих глаз одновременно. Участнику исследования будет предложено закрыть глаза. Будут отмечены любые признаки чрезмерного раздражения. Степень смачивания каждой полоски будет записана через 5 минут тестирования. Полоску собирают и хранят в пробирках Эппендорф на 1,5 мл при температуре -80°C до дальнейшего анализа.