着床失敗を繰り返す体外受精患者にマイクロアレイを使用したPGS

背景 体外受精（IVF）は、原因が男性であるか女性であるか、または原因が不明である不妊症を改善するための最も重要な方法です。 治療では通常、2～5日間培養した受精卵（胚）を子宮に移植します。 子宮内膜への移植が成功する可能性が最も高い胚を選択するために、現在、胚の細胞分裂、細胞の外観、およびその他の要因を評価するために顕微鏡評価が使用されています。 しかし、この方法は胚の機能特性や遺伝的に正常かどうかを判断できないため、不完全です。 複数回の体外受精治療の失敗の歴史を持つカップルは、異常な数の染色体 (異数性) を持つ多数の胚を生成することが知られており、これは 38 歳以上の女性にもよく見られます。

このプロジェクトでは、受精卵の染色体組成を決定するためにマイクロアレイ技術を用いた着床前遺伝子スクリーニング（PGS）を使用して、体外受精中に染色体が正常な胚のみを移植することを意図しています。 体外受精の失敗を繰り返してきた夫婦の妊娠・出産の確率を高めることを目的としています。 以前に、培養 3 日目の胚のサンプリング (生検) を使用して、高齢の女性 (> 38 歳) のターゲットグループに対して、同様の質問 (Ö 612-02) を使用した前向きランダム化研究を実施し、続いて 7 つの染色体を分析しました。 FISHテクニックを使ったペアリング。 この研究の結果、妊娠転帰の改善は見られませんでした。 その理由はおそらく 1) まず、このターゲット グループでは正常な卵がまれである。 2) 生検は、胚が敏感な段階にある 3 日目に行われました。 3) 合計 23 の染色体ペアのうち 7 つしか分析できませんでした。

この分野での方法論の発展は急速であり、現在の技術は、以前の研究と比較して正常な胚のより良い識別を可能にします。

• 生検を 3 日目ではなく 5 日目 (胚盤胞期) に行うと、胚の感度が低下することがわかっています。
• 胚盤胞生検では、3 日目の生検よりも多くの細胞が診断のために取り除かれます (それにより、分析の信頼性が向上します)。
• 胚盤胞生検では、以前に使用されていた 3 日目の生検と比較して、胚盤胞の総細胞量から割合ベース (3-5%) でより少ない細胞が除去され、細胞の総数の最大 25% が除去されました。
• 胚盤胞は、3 日目の胚よりも着床率が高くなります。
• アレイ比較ゲノム ハイブリダイゼーション (aCGH) を使用して、市販の品質管理キットを使用してすべての染色体を非常に正確に分析できるようになりました。
• 胚盤胞のガラス化による凍結保存は、現在非常に成功している技術であり、時間に追われることなく分析を行うことができます。

さらに、正常で良好な卵巣予備能が証明されている女性で構成される患者グループに目を向けます。 38歳以上の女性を対象とした以前の研究では、卵巣予備能は一般的に貧弱でした。

Genetic Integrity Act の準備作業では、PGS は「倫理委員会による倫理審査で承認された、明確に定義された研究プロジェクトのために留保されるべきである」と述べられています。 この制限が課されたのは、当時の PGS に関する知識が非常に限られていたためです。 PGS を臨床現場で使用できるかどうかを判断するには、PGS に関する研究プロジェクトからのより多くの経験が必要であると考えられました。 上記の遺伝子保全法の準備作業は、PGS が「体外受精治療と組み合わせて妊娠の可能性を高める重要なツールになる可能性がある...」とも述べています。 このプロジェクトでは、過去に体外受精に何度か失敗したカップルの間で、妊娠と出産の可能性を高めることができるかどうかを調査する予定です。 私たちの仮説は、不正確な数の染色体が着床の失敗や流産の根本的な原因であることが多いという仮定に基づいています。 出産につながる妊娠を確立する可能性を高めるために、カップルの胚の染色体分析を行って、正常な染色体セットを持つ胚のみが女性に移植されるようにします。

質問 以前に体外受精に何度か失敗したカップルの妊娠と出産の確率は、移植前に胚の正常な染色体セットを確保できれば増加しますか? コントロールとして、光学顕微鏡による評価のみが行われる IVF 試行の結果を比較します。

主要評価項目: 無作為化された患者ごとの出産 副次的評価項目: 残りのガラス化胚盤胞のその後の移植を含む累積妊娠率 (研究グループではより高い率が予想される)。 妊娠の最初の 18 週間の流産率 (研究グループではより低い率が予想されます)。

方法と材料 患者 39 歳までの女性で、少なくとも 3 回失敗した IVF の試みの歴史を持つカップルは、IVF スウェーデンのクリニックのいずれかで参加するための新しい IVF 治療の相談と併せて招待されます。研究では、それらが包含基準（8〜10個の卵でのホルモン刺激に対する予想される正常な反応を含む）を満たしていることを条件として. 研究への参加に同意した女性は、少なくとも 5 個の受精卵を持っている場合、卵母細胞の収集の翌日に生検グループまたは対照グループのいずれかに (コンピューターによって) 無作為に割り付けられます (5 日目の現在の培養手順)。

包含基準: IVF 治療の基準を満たし、分娩を伴わない胚移植を含む過去 3 回の IVF サイクルの履歴があるカップル。 研究が実施されるとき、女性は最大39歳である可能性があり、正常な良好な卵巣予備能（少なくとも12個の胞状卵胞）を持っている必要があります。 彼女のパートナーは、生きた精子を含む精液サンプルを提供できなければなりません。 研究に含まれる女性は、他の研究プロジェクトには参加しません。

除外基準：筋腫、または着床に影響すると判断された他の子宮病変。 機能的とは考えられない非特異的な嚢胞。 子宮内膜 > 3cm。

ランダム化

夫婦が胚盤胞段階まで培養するために確立された要件 (少なくとも 5 つの正常に受精した卵母細胞) を満たしている場合、無作為化は 1 日目に行われます。 オンラインランダム化プログラム (コンピューター化) は、次のパラメーターのバランスをとります。

• 年
• 採卵数

さらに、無作為化の時点で、無作為化プログラムは、偏りを避けるために多施設研究が関与することを考慮に入れます。

IVF 治療 ホルモン刺激、超音波検査、卵母細胞の採取、受精は標準的な手順に従います。 対照群の女性の場合、すべての拡大胚盤胞は、5 ～ 6 日後に移植するために凍結保存 (ガラス化) されます。 PGS に無作為に割り付けられた女性の場合、細胞 (胚の外側の細胞層にある栄養外胚葉細胞) を 5 ～ 6 日目に生検し、その後生検したすべての胚盤胞をガラス化します。 分析で正常な染色体セットが示された場合、胚盤胞は解凍され、次の月経周期中に移植されます。

生検と細胞溶解 生検は、レーザー技術と特殊な生検装置を使用して胚盤胞 (透明帯) の殻に穴を開け、外側の細胞塊 (栄養膜細胞) から 2 ～ 5 個の細胞を除去することによって行われます。 細胞をＰＢＳ溶液を含む試験管に移す。 抽出溶液を加えて細胞を溶解すると、DNA が溶液に放出されます。

ゲノム増幅の最適化 細胞溶解および全ゲノム増幅のプロトコルを最適化するために、13 トリソミーの胚性幹細胞株および正常核型の細胞を使用します。 3、4、5 個の細胞をそれぞれ PCR チューブにピペッティングします。 aCGH プロトコル全体 (下記参照) をこれらの細胞 (少なくとも 50 チューブ) で実行し、結果を評価します。 このアプローチにより、メソッドの感度と、増幅の失敗により結果が得られない頻度についてのアイデアが得られます。 システム内の汚染があれば、それも明らかになります。

アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション (aCGH) DNA の増幅 (コピー) のための試薬が DNA 抽出物に加えられます。 増幅は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）と呼ばれる技術を使用して、いくつかのステップで実行されます。 このプロセスには、外来DNAがサンプルを汚染しないように、非常に正確で特別な実験室設備が必要です。 この段階での汚染は、胚の染色体構成の誤診につながる可能性があります。 増幅された DNA は、UV 照射下で DNA が緑色の蛍光を発する蛍光分子で標識されます。 同様に、通常のコントロール DNA は、UV 照射下で赤く蛍光を発する分子で標識されています。 増幅された蛍光標識 DNA は、等量の通常の蛍光標識コントロール DNA と混合されます。 この DNA 混合物は、特定の DNA 配列を持つテスト表面に適用されます。 これらの DNA 配列は慎重に選択され、特定の順序で長い配列でテスト表面に配置されます。つまり、すべての染色体アームからの DNA がテスト表面の特定の位置に表示されます。 ハイブリダイゼーション ステップの間、DNA 混合物中の DNA は、試験表面上の DNA への結合をめぐって競合します。 増幅された DNA (緑) とコントロール DNA (赤) の量が等しい場合、両方の画分から等量の DNA がテスト表面に結合します。 ハイブリダイゼーション後、試験面に UV 光を当てると、緑と赤の蛍光が等しく強くなり、結果としてオレンジ色になります (赤と緑が等分された混合物)。 しかし、胚の所定の染色体からの DNA が過剰に存在する場合 (例えば、トリソミー)、この染色体からのより多くの DNA 配列がテスト表面に結合し、テスト表面の過剰な緑色蛍光が含まれます。関連する染色体からの DNA 配列。 同様に、胚の染色体が失われると、増幅された画分で対応する DNA が不足し、より多くのコントロール DNA 配列 (赤) がテスト表面に結合します。 テスト領域がスキャンされ、結果はコンピューター化されたスキャナーで自動的に処理されます。

胚のグレーディング:

胚盤胞の評価と等級付けは、拡大の程度、細胞密度、内部細胞塊 (IC) および栄養外胚葉 (TE) の細胞数が評価される Gardner による承認された分類に従って行われます。 対照群のすべての胚盤胞は、後で転送するためにガラス化されます。 同様の評価は、生検の前に生検グループで実施されます。 生検に続いて、生検されたすべての胚盤胞がガラス化されます。

生検が行われるグループでは、マイクロアレイ分析が行われます。 移植は、排卵から 5 日後の自然な月経周期中に行われます。 ホルモン障害のある女性は、ガラス化/温めた胚盤胞を移植する前に、軽度のホルモン刺激を必要とします。

ガラス化 胚盤胞が生検された後、それらはガラス化され、その後クリニックで確立されたプロトコルに従って解凍されます。

フォローアップ 主要エンドポイントは、無作為化された患者ごとの出生です。 二次エンドポイントは、追加の凍結保存された胚盤胞（存在する場合）も移植されるため、累積妊娠率、および妊娠の最初の18週間の流産率（研究グループではより低い率が予想される）です。 調査の半分が完了したら、独立した外部の専門家で構成されるデータ安全監視委員会 (DSMB) を作成する予定です。

すべての妊娠と出産のフォローアップは、IVF 内の現在の手順に従って実施されます。

Statistics Power 分析によると、対照群の推定 15% から PGS 群の 40% までの妊娠転帰の有意差を検出するには、112 人の患者が必要であることが示されています (アルファ = 0.8; ベータ=0.20)。 約 10% の推定減少率と計画された DSMB 分析は、130 人の患者を募集する必要があることを意味します。 DSMB は調査を監視し、調査を継続すべきかどうかについて定期的にアドバイスを提供します。 DSMB 分析では、(1) 計画どおりに研究を続行する、(2) グループ間の差が 15% 未満の場合は研究を中止する、(3) より大きなサンプル サイズで研究を続行する、という 3 つの推奨事項が示されます。 グループ間の差が 20% 以上の場合、より大きなサンプル サイズ (各グループ 73 人の患者) で研究を続行できます DSMB 分析は、研究を続行するか中止するかをアドバイスします (非常に有意な効果、負の効果、または条件が低いため)力。 DSMB は、生児出産と進行中の妊娠の両方を評価し、勧告を行う際にすべての情報を比較検討できます。 DSMB は、この分野で経験を積んだスペシャリストで構成されます。 統計計算は、治療意図 (ITT) に従って、およびプロトコルごとに実行されます。 ITT はすべて無作為化された患者であり、1 日目に少なくとも 5 つの受精卵母細胞を持っています。 一部の患者は、胚盤胞の欠如、またはガラス化/加温などに関連する技術的な問題により、転送されない可能性があります. したがって、分析もプロトコルごとに行われます。 統計計算ではロジスティック回帰が使用され、層化変数が含まれます。