PGS przy użyciu mikromacierzy u pacjentów IVF z powtarzającymi się niepowodzeniami implantacji

Tło Zapłodnienie in vitro (IVF) jest najważniejszą metodą leczenia niepłodności, niezależnie od tego, czy przyczyną jest mężczyzna, czy kobieta, lub gdy przyczyna jest nieznana. Leczenie zwykle obejmuje przeniesienie do macicy zapłodnionego jaja (zarodka), które hodowano przez 2-5 dni. Aby wybrać zarodek z największą szansą na udaną implantację do endometrium, obecnie stosuje się ocenę mikroskopową w celu oceny podziału komórek embrionalnych, wyglądu komórek i innych czynników. Ale ta metoda jest niekompletna, ponieważ nie może określić właściwości funkcjonalnych zarodka ani tego, czy jest on genetycznie normalny. Wiadomo, że pary z historią wielu nieudanych zabiegów IVF produkują dużą liczbę zarodków z nieprawidłową liczbą chromosomów (aneuploidia), co jest również powszechne u kobiet w wieku powyżej 38 lat.

Projekt ten ma na celu wykorzystanie preimplantacyjnego genetycznego skriningu (PGS) z techniką mikromacierzy do określenia składu chromosomów zapłodnionych komórek jajowych, tak aby podczas zapłodnienia pozaustrojowego przenoszone były tylko zarodki o prawidłowym chromosomie. Celem jest zwiększenie prawdopodobieństwa ciąży i porodu wśród par z historią powtarzających się nieudanych prób zapłodnienia in vitro. Wcześniej przeprowadziliśmy prospektywne, randomizowane badanie z podobnym pytaniem (Ö 612-02) na docelowej grupie starszych kobiet (>38 lat), stosując pobieranie (biopsję) zarodka w 3 dniu hodowli, a następnie analizę siedmiu chromosomów w pary techniką FISH. Wyniki badania nie wykazały poprawy przebiegu ciąży. Przyczyny są prawdopodobnie następujące: 1) po pierwsze, normalne jaja są rzadkie w tej grupie docelowej; 2) biopsję wykonano w 3. dobie, gdy zarodek jest w fazie wrażliwej; i 3) tylko 7 z 23 par chromosomów można było przeanalizować.

Rozwój metodologiczny w tej dziedzinie był szybki, a obecna technologia pozwala na lepszą identyfikację normalnych zarodków w porównaniu z poprzednim badaniem.

• Wiadomo, że zarodek jest mniej wrażliwy, gdy biopsję wykonuje się w 5. dniu (stadium blastocysty) zamiast w 3. dniu.
• W biopsji blastocysty pobiera się więcej komórek do postawienia diagnozy niż w przypadku biopsji trzeciego dnia (co zwiększa wiarygodność analizy).
• Biopsja blastocysty polega na usunięciu procentowo mniejszej liczby komórek (3-5%) z całkowitej masy komórek blastocysty w porównaniu z wcześniej stosowaną biopsją trzeciego dnia, która obejmowała usunięcie do 25% całkowitej liczby komórek.
• Blastocysty mają wyższy wskaźnik implantacji niż zarodki dnia 3.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) może być teraz używany z dużą precyzją do analizy wszystkich chromosomów przy użyciu komercyjnych zestawów o kontrolowanej jakości.
• Kriokonserwacja z witryfikacją blastocyst jest obecnie bardzo skuteczną techniką, która pozwala na przeprowadzenie analizy bez presji czasu.

Ponadto zwrócimy się do grupy pacjentek składającej się z kobiet z potwierdzoną rezerwą jajnikową w normie-dobrej. W poprzednim badaniu z udziałem kobiet w wieku >38 lat rezerwa jajnikowa była na ogół niska.

W pracach przygotowawczych do ustawy o integralności genetycznej stwierdzono, że PGS powinien „być zarezerwowany dla jasno określonych projektów badawczych zatwierdzonych w ramach oceny etycznej przez komisję etyczną”. Ograniczenie to zostało nałożone, ponieważ ówczesny stan wiedzy o PGS był bardzo ograniczony. Uznano, że potrzebne jest większe doświadczenie z projektów badawczych nad PGS, aby określić, czy PGS może być stosowany w praktyce klinicznej. We wspomnianych powyżej pracach przygotowawczych do ustawy o integralności genetycznej stwierdza się również, że PGS „może stać się ważnym narzędziem zwiększania szans na ciążę w połączeniu z leczeniem IVF…”. W tym projekcie zamierzamy zbadać, czy możliwe jest zwiększenie szansy na ciążę i poród wśród par, które przeszły kilka wcześniejszych nieudanych prób zapłodnienia in vitro. Nasza hipoteza opiera się na założeniu, że nieprawidłowa liczba chromosomów jest często przyczyną nieudanej implantacji lub poronienia. Aby zwiększyć szanse na zajście w ciążę prowadzącą do porodu, przeprowadzamy analizę chromosomów zarodków par, aby upewnić się, że kobiecie zostaną przekazane tylko zarodki z prawidłowym zestawem chromosomów.

Pytanie Czy prawdopodobieństwo zajścia w ciążę i porodu u par, które miały kilka wcześniejszych nieudanych prób zapłodnienia in vitro, może wzrosnąć, jeśli można zapewnić normalny zestaw chromosomów w zarodku przed jego transferem? Jako kontrolę porównamy wyniki prób IVF, w których dokonywana jest jedynie ocena mikroskopowa.

Pierwszorzędowy punkt końcowy: Poród na randomizowaną pacjentkę. Drugorzędowe punkty końcowe: Skumulowany odsetek ciąż, w tym późniejsze przeniesienie pozostałych zeszklonych blastocyst (oczekiwany wyższy odsetek w grupie badanej). Wskaźnik poronień w pierwszych 18 tygodniach ciąży (w grupie badanej spodziewany niższy wskaźnik).

Metody i materiały Pacjenci Pary z historią co najmniej trzech nieudanych prób zapłodnienia in vitro, w których kobieta ma maksymalnie 39 lat, zostaną zaproszone wraz z konsultacją na nowe leczenie in vitro w dowolnej szwedzkiej klinice IVF do udziału w badaniu, pod warunkiem spełnienia kryteriów włączenia (w tym oczekiwanej normalnej odpowiedzi na stymulację hormonalną z 8-10 jajami). Kobiety, które wyrażą zgodę na udział w badaniu, zostaną losowo przydzielone (komputerowo) do grupy biopsyjnej lub kontrolnej dzień po pobraniu oocytów, jeśli posiadają co najmniej 5 zapłodnionych komórek jajowych (obecna procedura hodowli w dniu 5).

Kryteria włączenia: Pary, które spełniają kryteria leczenia IVF i które mają co najmniej trzy poprzednie cykle IVF, w tym transfer zarodka bez porodu. Kobieta może mieć maksymalnie 39 lat w momencie przeprowadzania badania i musi mieć prawidłową rezerwę jajnikową (co najmniej 12 pęcherzyków antralnych). Jej partner musi być w stanie dostarczyć próbkę nasienia zawierającą żywe plemniki. Kobiety objęte badaniem nie będą brały udziału w żadnym innym projekcie badawczym.

Kryteria wykluczenia: Mięśniak lub inne zmiany w macicy, które mogą mieć wpływ na implantację. Niespecyficzne torbiele, które nie są uważane za funkcjonalne. Endometrium >3 cm.

Randomizacja

Randomizacja odbędzie się w 1. dniu, jeśli para spełni wymagania ustalone dla hodowli do stadium blastocysty (co najmniej 5 normalnie zapłodnionych oocytów). Program randomizacji on-line (skomputeryzowany) zrównoważy następujące parametry:

• Wiek
• Liczba pobranych oocytów

Ponadto w czasie randomizacji program randomizacji weźmie pod uwagę, że w celu uniknięcia stronniczości zaangażowane jest badanie wieloośrodkowe.

Leczenie IVF Stymulacja hormonalna, badania ultrasonograficzne, pobranie oocytów i zapłodnienie przebiegają zgodnie ze standardową procedurą. W przypadku kobiet z grupy kontrolnej wszystkie namnożone blastocysty będą kriokonserwowane (zeszklone) w dniach 5-6 w celu późniejszego przeniesienia. W przypadku kobiet zrandomizowanych do grupy PGS komórki (komórki trofektodermy w zewnętrznej warstwie komórkowej zarodka) zostaną poddane biopsji w dniach 5-6, po czym wszystkie poddane biopsji blastocysty zostaną poddane witryfikacji. Jeśli analiza wykaże prawidłowy zestaw chromosomów, blastocysta zostanie rozmrożona i przeniesiona podczas następnego cyklu miesiączkowego.

Biopsja i liza komórek Biopsja polega na wykonaniu otworu w otoczce blastocysty (zona pellucida) przy użyciu technologii laserowej i specjalnego sprzętu do biopsji oraz usunięciu 2-5 komórek z zewnętrznej masy komórkowej (komórek trofoblastu). Komórki przenosi się do probówki zawierającej roztwór PBS. Dodaje się roztwór do ekstrakcji w celu lizy komórek, a DNA uwalnia się do roztworu.

Optymalizacja amplifikacji genomu W celu optymalizacji protokołu lizy komórek i amplifikacji całego genomu wykorzystane zostaną komórki z linii embrionalnych komórek macierzystych z trisomią 13 oraz z prawidłowego kariotypu. Odpowiednio trzy, cztery i pięć komórek zostanie odpipetowanych do probówek do PCR. Cały protokół aCGH (patrz poniżej) zostanie przeprowadzony na tych komórkach (co najmniej 50 probówek), a wyniki zostaną ocenione. Takie podejście da nam wyobrażenie o czułości metody io tym, jak często nie uzyskujemy wyników z powodu nieudanej amplifikacji. Ewentualne zanieczyszczenie w systemie również zostanie ujawnione.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Odczynnik do amplifikacji (kopiowania) DNA jest dodawany do ekstraktu DNA. Amplifikację przeprowadza się w kilku etapach, stosując technikę zwaną „reakcją łańcuchową polimerazy” (PCR). Proces ten wymaga dużej dokładności i specjalnego zaplecza laboratoryjnego, aby obcy DNA nie zanieczyszczał próbki. Zanieczyszczenie na tym etapie może prowadzić do błędnej diagnozy budowy chromosomów zarodków. Amplifikowany DNA jest następnie znakowany cząsteczką fluorescencyjną, która powoduje, że DNA fluoryzuje na zielono w świetle UV. Podobnie normalne kontrolne DNA jest znakowane cząsteczką, która fluoryzuje na czerwono w świetle UV. Amplifikowany fluorescencyjnie znakowany DNA miesza się z równą objętością normalnego kontrolnego DNA znakowanego fluorescencyjnie. Ta mieszanina DNA jest nakładana na powierzchnie testowe z określonymi sekwencjami DNA. Te sekwencje DNA są starannie wybierane i umieszczane na powierzchniach testowych w długich macierzach w określonej kolejności, co oznacza, że ​​DNA ze wszystkich ramion chromosomów jest reprezentowane na powierzchni testowej w określonych miejscach. Podczas etapu hybrydyzacji DNA w mieszaninie DNA będzie współzawodniczyć o wiązanie z DNA na testowanej powierzchni. Jeśli są równe ilości zamplifikowanego DNA (zielony) i kontrolnego DNA (czerwony), to równa ilość DNA z obu frakcji zwiąże się z powierzchnią testową. Po hybrydyzacji, gdy badana powierzchnia zostanie oświetlona światłem UV, fluorescencja zielona i czerwona będą jednakowo intensywne, co da kolor pomarańczowy (mieszanka równych części koloru czerwonego i zielonego). Jeśli jednak w zarodku występuje nadmiar DNA z danego chromosomu (np. trisomia), więcej sekwencji DNA z tego chromosomu zwiąże się z powierzchnią testową, co spowoduje nadmiar zielonej fluorescencji w obszarze na powierzchni testowej zawierający sekwencje DNA z odpowiedniego chromosomu. Podobnie utrata chromosomu w zarodku skutkuje niedoborem odpowiedniego DNA we zamplifikowanej frakcji, co powoduje, że więcej kontrolnych sekwencji DNA (kolor czerwony) wiąże się z powierzchnią testową. Obszary testowe są skanowane, a wyniki przetwarzane automatycznie w skomputeryzowanym skanerze.

Klasyfikacja zarodków:

Ocenę i klasyfikację blastocyst przeprowadza się zgodnie z przyjętą klasyfikacją według Gardnera, według której ocenia się stopień ekspansji, gęstość komórek i liczbę komórek w wewnętrznej masie komórkowej (IC) iw trofektodermie (TE). Wszystkie blastocysty w grupie kontrolnej zostaną zeszklone do późniejszego przeniesienia. Podobna ocena zostanie przeprowadzona w grupie biopsji przed biopsją. Po biopsji wszystkie poddane biopsji blastocysty zostaną zeszklone.

W grupie, w której wykonywana jest biopsja, zostanie przeprowadzona analiza mikromacierzy. Transfer odbywa się podczas naturalnego cyklu miesiączkowego 5 dni po owulacji. Kobiety z zaburzeniami hormonalnymi wymagają łagodnej stymulacji hormonalnej przed przeniesieniem zeszklonej/ogrzanej blastocysty.

Witryfikacja Po pobraniu blastocyst poddaje się je procesowi witryfikacji, a następnie rozmrażaniu zgodnie z ustalonym protokołem klinicznym.

Obserwacja Pierwszorzędowym punktem końcowym jest urodzenie na randomizowanego pacjenta. Drugorzędowymi punktami końcowymi są skumulowany odsetek ciąż, ponieważ transferowane są również dodatkowe kriokonserwowane blastocysty (jeśli występują), oraz odsetek poronień w ciągu pierwszych 18 tygodni ciąży (niższy odsetek oczekiwany w grupie badanej). Po zakończeniu połowy badania planujemy utworzyć Radę ds. Monitorowania Bezpieczeństwa Danych (DSMB) składającą się z niezależnych ekspertów zewnętrznych.

Kontrola wszystkich ciąż i porodów będzie prowadzona zgodnie z obowiązującą procedurą w ramach IVF.

Analiza mocy statystyk wykazała, że ​​wykrycie znaczącej różnicy w wynikach ciąży od szacowanych 15% w grupie kontrolnej do 40% w grupie PGS wymaga 112 pacjentek (alfa=0,8; Beta=0,20). Szacunkowy wskaźnik ścierania na poziomie około 10% oraz planowana analiza DSMB oznaczają, że należy zrekrutować 130 pacjentów. DSMB będzie monitorować badanie i udzielać okresowych porad, czy powinniśmy je kontynuować. Analiza DSMB da 3 zalecenia: (1) kontynuować badanie zgodnie z planem, (2) przerwać badanie, jeśli różnica między grupami jest mniejsza niż 15%, (3) kontynuować badanie na większej próbie. Gdy różnica między grupami wynosi 20% lub więcej, badanie można kontynuować na większej próbie (73 pacjentów w każdej grupie). moc. DSMB może ocenić zarówno żywy poród, jak i trwającą ciążę oraz zważyć wszystkie informacje, gdy wyda zalecenie. DSMB składać się będzie ze specjalistów, którzy mają doświadczenie w tej dziedzinie. Obliczenia statystyczne zostaną przeprowadzone zgodnie z zamiarem leczenia (ITT), jak również zgodnie z protokołem. ITT to wszyscy randomizowani pacjenci, u których w 1. dniu doszło do co najmniej 5 zapłodnionych komórek jajowych. Niektórzy pacjenci prawdopodobnie nie zostaną przeniesieni z powodu braku blastocyst lub problemów technicznych związanych ze witryfikacją/ogrzewaniem itp. W związku z tym analiza zostanie również przeprowadzona zgodnie z protokołem. Regresja logistyczna zostanie wykorzystana w obliczeniach statystycznych i uwzględni zmienne stratyfikacyjne.