PGS Microarrayn käyttäminen IVF-potilailla, joilla on toistuva implantaatiovirhe

Tausta Koeputkihedelmöitys (IVF) on tärkein menetelmä hedelmättömyyden hoitoon riippumatta siitä, onko syynä mies tai nainen, tai kun syytä ei tiedetä. Hoito käsittää yleensä hedelmöittyneen munasolun (alkion) siirtämisen kohtuun, jota on viljelty 2–5 päivää. Sellaisen alkion valitsemiseksi, jolla on parhaat mahdollisuudet implantoitua kohdun limakalvoon, mikroskooppista arviointia käytetään tällä hetkellä alkion solujen jakautumisen, solujen ulkonäön ja muiden tekijöiden arvioimiseksi. Mutta tämä menetelmä on epätäydellinen, koska se ei voi määrittää alkion toiminnallisia ominaisuuksia tai sitä, onko se geneettisesti normaali. Tiedetään, että parit, joilla on ollut useita epäonnistuneita IVF-hoitoja, tuottavat suuren määrän alkioita, joissa on epänormaali määrä kromosomeja (aneuploidia), mikä on yleistä myös yli 38-vuotiailla naisilla.

Tässä hankkeessa on tarkoitus käyttää preimplantaatiogeneettistä seulontaa (PGS) microarray-tekniikalla hedelmöittyneiden munien kromosomikoostumuksen määrittämiseen siten, että vain kromosomaalisesti normaalit alkiot siirtyvät IVF:n aikana. Tarkoituksena on lisätä raskauden ja synnytyksen todennäköisyyttä pariskunnilla, joilla on toistuvasti epäonnistuneita IVF-yrityksiä. Olemme aiemmin tehneet prospektiivisen satunnaistetun tutkimuksen samanlaisella kysymyksellä (Ö 612-02) kohderyhmällä iäkkäitä naisia ​​(>38 vuotta) käyttämällä alkiosta näytteenottoa (biopsia) viljelypäivänä 3, mitä seurasi seitsemän kromosomin analyysi. parit FISH-tekniikalla. Tutkimuksen tulokset eivät osoittaneet parannusta raskauden lopputulokseen. Syyt ovat luultavasti 1) aluksi normaalit munat ovat harvinaisia ​​tässä kohderyhmässä; 2) biopsia tehtiin päivänä 3, kun alkio on herkässä vaiheessa; ja 3) vain 7 kaikkiaan 23 kromosomiparista voitiin analysoida.

Alan metodologinen kehitys on ollut nopeaa, ja nykyinen teknologia mahdollistaa normaalien alkioiden paremman tunnistamisen edelliseen tutkimukseen verrattuna.

• Tiedämme, että alkio on vähemmän herkkä, kun biopsia tehdään 5. päivänä (blastokystivaiheessa) päivän 3 sijasta.
• Blastokystibiopsiassa diagnoosia varten poistetaan enemmän soluja kuin 3. päivän biopsiassa (täten analyysin luotettavuus lisääntyy).
• Blastokystabiopsia sisältää prosentuaalisen määrän (3-5 %) poistamisen blastokystan kokonaissolumassasta verrattuna aiemmin käytettyyn 3. päivän biopsiaan, jossa poistettiin jopa 25 % solujen kokonaismäärästä.
• Blastokystillä on suurempi implantaationopeus kuin päivän 3 alkioilla.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) -menetelmää voidaan nyt käyttää erittäin tarkasti kaikkien kromosomien analysointiin käyttämällä kaupallisia laatukontrolloituja sarjoja.
• Kryosäilytys blastokystien lasituksella on tällä hetkellä erittäin onnistunut tekniikka, joka mahdollistaa analyysin suorittamisen ilman ajan kiirettä.

Lisäksi käännymme potilasryhmään, joka koostuu naisista, joilla on todistetusti normaali-hyvä munasarjareservi. Edellisessä tutkimuksessa, johon osallistui yli 38-vuotiaita naisia, munasarjavarasto oli yleensä huono.

Geneettisen eheyden lain valmistelutyössä todettiin, että PGS:n tulisi "varattua selkeästi määritellyille tutkimusprojekteille, jotka eettinen komitea on hyväksynyt eettisessä katsauksessa". Tämä rajoitus määrättiin, koska PGS:n tietämys oli tuolloin hyvin rajallinen. Lisää kokemusta PGS-tutkimusprojekteista katsottiin tarpeelliseksi määrittää, voidaanko PGS:ää käyttää kliinisessä käytännössä. Yllä mainitussa Genetic Integrity Actin valmistelutyössä todetaan myös, että PGS:stä "voi tulla tärkeä työkalu raskauden mahdollisuuksien lisäämiseksi IVF-hoidon yhteydessä...". Tässä hankkeessa aiomme selvittää, onko mahdollista lisätä raskauden ja synnytyksen mahdollisuutta pariskunnille, jotka ovat kokeneet useita epäonnistuneita IVF-yrityksiä. Hypoteesimme perustuu olettamukseen, että väärä kromosomien lukumäärä on usein epäonnistuneen implantaation tai keskenmenon taustalla. Synnytykseen johtavan raskauden todennäköisyyden lisäämiseksi teemme parien alkioiden kromosomianalyysin varmistaaksemme, että naiselle siirtyy vain alkiot, joilla on normaali kromosomiryhmä.

Kysymys Voiko raskauden ja synnytyksen todennäköisyys kasvaa pariskunnilla, joilla on useita epäonnistuneita IVF-yrityksiä, jos alkiossa voidaan varmistaa normaali kromosomisarja ennen sen siirtoa? Kontrollina vertaamme tuloksia IVF-yrityksistä, joissa suoritetaan vain valomikroskooppinen arviointi.

Ensisijainen päätetapahtuma: Toimitus satunnaistettua potilasta kohti Toissijaiset päätetapahtumat: kumulatiivinen raskausaste, mukaan lukien jäljellä olevien lasitettujen blastokystien myöhempi siirtyminen (suurempaa määrää odotetaan tutkimusryhmässä). Keskenmenojen määrä ensimmäisten 18 raskausviikon aikana (tutkimusryhmässä odotettiin alhaisempaa määrää).

Menetelmät ja materiaalit Potilaat Pariskunnat, joilla on vähintään kolme epäonnistunutta IVF-yritystä ja joissa nainen on enintään 39-vuotias, kutsutaan konsultaationsa yhteydessä uuteen IVF-hoitoon millä tahansa IVF Swedenin klinikalla. tutkimuksessa edellyttäen, että ne täyttävät osallistumiskriteerit (mukaan lukien odotettu normaali vaste hormonistimulaatioon 8–10 munalla). Naiset, jotka suostuvat osallistumaan tutkimukseen, satunnaistetaan (tietokoneella) joko biopsiaan tai kontrolliryhmään munasolujen keräämisen jälkeisenä päivänä, jos heillä on vähintään 5 hedelmöitettyä munasolua (nykyinen viljelymenetelmä päivänä 5).

Osallistumiskriteerit: Parit, jotka täyttävät IVF-hoidon kriteerit ja joilla on vähintään kolme aiempaa IVF-sykliä, mukaan lukien alkionsiirto ilman synnytystä. Nainen voi olla tutkimusta tehtäessä enintään 39-vuotias, ja hänellä tulee olla normaali-hyvä munasarjavarasto (vähintään 12 anturaalista follikkelia). Hänen kumppaninsa on pystyttävä toimittamaan siemennestenäyte, joka sisältää eläviä siittiöitä. Tutkimukseen osallistuvat naiset eivät osallistu mihinkään muuhun tutkimusprojektiin.

Poissulkemiskriteerit: Myooma tai muut kohdun leesiot, joiden arvioitiin vaikuttavan implantaatioon. Epäspesifiset kystat, joita ei pidetä toimivina. Endometrium > 3 cm.

Satunnaistaminen

Satunnaistaminen tapahtuu päivänä 1, jos pari täyttää blastokystivaiheen viljelylle asetetut vaatimukset (vähintään 5 normaalisti hedelmöitettyä munasolua). On-line satunnaistusohjelma (tietokoneistettu) tasapainottaa seuraavat parametrit:

• Ikä
• Haettujen munasolujen määrä

Lisäksi satunnaistamisen yhteydessä satunnaistusohjelma ottaa huomioon, että mukana on monikeskustutkimus puolueellisuuden välttämiseksi.

IVF-hoito Hormonistimulaatio, ultraäänitutkimukset, munasolujen kerääminen ja hedelmöitys noudattavat vakiomenettelyjä. Vertailuryhmän naisilla kaikki laajentuneet blastokystat kylmäsäilytetään (lasitettu) päivänä 5-6 myöhempää siirtoa varten. Naisille, jotka on satunnaistettu PGS:ään, solut (trofektodermisolut alkion uloimmassa solukerroksessa) otetaan biopsia päivänä 5-6, minkä jälkeen kaikki biopsioidut blastokystat lasitetaan. Jos analyysi osoittaa normaalin kromosomisarjan, blastokysta sulatetaan ja siirretään seuraavan kuukautiskierron aikana.

Biopsia ja solujen lyysi Biopsia tehdään tekemällä reikä blastokystan (zona pellucida) kuoreen laserteknologialla ja erityisillä biopsialaitteistoilla ja poistamalla 2-5 solua ulomman solumassasta (trofoblastisolut). Solut siirretään koeputkeen, joka sisältää PBS-liuosta. Uuttoliuos lisätään solujen hajottamiseksi, ja DNA vapautetaan liuokseen.

Genomin monistamisen optimointi Protokollan optimoimiseksi solujen hajoamista ja koko genomin monistusta varten käytetään soluja alkion kantasolulinjasta, jossa on trisomia 13, sekä normaalista karyotyypistä. Kolme, neljä ja viisi solua pipetoidaan vastaavasti PCR-putkiin. Koko aCGH-protokolla (katso alla) ajetaan näillä soluilla (vähintään 50 putkea), ja tulokset arvioidaan. Tämä lähestymistapa antaa meille käsityksen menetelmän herkkyydestä ja siitä, kuinka usein emme saa tuloksia epäonnistuneen vahvistuksen vuoksi. Myös järjestelmän mahdollinen kontaminaatio paljastetaan.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) -reagenssi DNA:n monistamiseksi (kopioimiseksi) lisätään DNA-uutteeseen. Monistaminen suoritetaan useissa vaiheissa käyttämällä tekniikkaa, jota kutsutaan "polymeraasiketjureaktioksi" (PCR). Tämä prosessi vaatii suurta tarkkuutta ja erityisiä laboratoriotiloja, jotta vieras DNA ei saastuta näytettä. Kontaminaatio tässä vaiheessa voi johtaa alkioiden kromosomirakenteen virheelliseen diagnoosiin. Monistettu DNA leimataan sitten fluoresoivalla molekyylillä, joka saa DNA:n fluoresoimaan vihreänä UV-valossa. Samalla tavalla normaali kontrolli-DNA on leimattu molekyylillä, joka fluoresoi punaisena UV-valossa. Monistettu fluoresoivasti leimattu DNA sekoitetaan yhtä suuren tilavuuden kanssa normaalia fluoresoivasti leimattua kontrolli-DNA:ta. Tätä DNA-seosta levitetään testipinnoille, joissa on spesifisiä DNA-sekvenssejä. Nämä DNA-sekvenssit valitaan huolellisesti ja asetetaan testipinnoille pitkiin ryhmiin tietyssä järjestyksessä, mikä tarkoittaa, että kaikkien kromosomihaarojen DNA on edustettuna testipinnalla tietyissä kohdissa. Hybridisaatiovaiheen aikana DNA-seoksen DNA kilpailee sitoutumisesta testipinnalla olevaan DNA:han. Jos monistettua DNA:ta (vihreä) ja kontrolli-DNA:ta (punainen) on yhtä paljon, niin sama määrä DNA:ta molemmista fraktioista sitoutuu testipintaan. Hybridisaation jälkeen, kun testipinta valaistaan ​​UV-valolla, vihreä ja punainen fluoresenssi ovat yhtä voimakkaita, mikä johtaa oranssiin väriin (seos, jossa on yhtä paljon punaista ja vihreää väriä). Jos alkiossa on kuitenkin ylimäärin DNA:ta tietystä kromosomista (esim. trisomia), enemmän DNA-sekvenssejä tästä kromosomista sitoutuu testipintaan, mikä johtaa ylimääräiseen vihreään fluoresenssiin testipinnan alueella, joka sisältää DNA-sekvenssit asiaankuuluvasta kromosomista. Samoin kromosomin menetys alkiossa johtaa vastaavan DNA:n puutteeseen amplifioidussa fraktiossa, jolloin enemmän kontrolli-DNA-sekvenssejä (punainen) sitoutuu testipintaan. Testialueet skannataan ja tulokset käsitellään automaattisesti tietokoneskannerissa.

Alkioiden luokittelu:

Blastokystien arviointi ja luokittelu suoritetaan Gardnerin hyväksytyn luokituksen mukaisesti, jossa laajenemisaste, solutiheys ja solujen lukumäärä sisäisessä solumassassa (IC) ja trofektodermissa (TE) arvioidaan. Kaikki kontrolliryhmän blastokystit lasitetaan myöhempää siirtoa varten. Samanlainen arviointi suoritetaan biopsiaryhmässä ennen biopsiaa. Biopsian jälkeen kaikki biopsioidut blastokystat lasitetaan.

Ryhmässä, jossa biopsia suoritetaan, suoritetaan mikrosiruanalyysi. Siirto tapahtuu luonnollisen kuukautiskierron aikana 5 päivää ovulaation jälkeen. Naiset, joilla on hormonaalisia häiriöitä, tarvitsevat lievää hormonaalista stimulaatiota ennen lasitetun/lämmitetyn blastokystin siirtoa.

Lasitus Kun blastokysta on otettu biopsiasta, ne lasitetaan ja sulatetaan sen jälkeen klinikoilla vakiintuneen protokollan mukaisesti.

Seuranta Ensisijainen päätetapahtuma on syntymä satunnaistettua potilasta kohti. Toissijaisia ​​päätepisteitä ovat kumulatiivinen raskausaste, koska myös ylimääräisiä kylmäsäilytettyjä blastokytoja (jos sellaisia ​​on) siirretään, ja keskenmenojen määrä ensimmäisten 18 raskausviikon aikana (tutkimusryhmässä odotettiin alhaisempaa määrää). Suunnittelemme perustavamme riippumattomista ulkopuolisista asiantuntijoista koostuvan Data Safety Monitoring Boardin (DSMB), kun puolet tutkimuksesta on valmis.

Kaikkien raskauksien ja synnytysten seuranta suoritetaan IVF:n nykyisen menettelyn mukaisesti.

Tilastot Tehoanalyysi on osoittanut, että merkittävän eron havaitsemiseksi raskauden tuloksissa kontrolliryhmän arvioidusta 15 prosentista PGS-ryhmän 40 prosenttiin vaatii 112 potilasta (alfa=0,8; beeta = 0,20). Arvioitu poistumisaste on noin 10 % ja suunniteltu DSMB-analyysi tarkoittavat, että 130 potilasta tulisi rekrytoida. DSMB seuraa tutkimusta ja antaa määräajoin neuvoja siitä, pitäisikö meidän jatkaa tutkimusta. DSMB-analyysi antaa 3 suositusta: (1) jatkaa tutkimusta suunnitellusti, (2) keskeyttää tutkimus, jos ryhmien välinen ero on alle 15 %, (3) jatkaa tutkimusta suuremmalla otoskoolla. Kun ero ryhmien välillä on 20 % tai suurempi, tutkimusta voidaan jatkaa suuremmalla otoskoolla (73 potilasta kussakin ryhmässä DSMB-analyysi neuvoo jatkamaan tai lopettamaan tutkimuksen (erittäin merkittävän vaikutuksen, negatiivisen vaikutuksen tai alhaisen ehdollisen vaikutuksen vuoksi). tehoa. DSMB voi arvioida sekä elävänä syntymän että meneillään olevan raskauden ja punnita kaikki tiedot suosituksen antaessaan. DSMB koostuu asiantuntijoista, joilla on kokemusta tällä alalla. Tilastolliset laskelmat suoritetaan hoitotarkoituksen (ITT) mukaan sekä protokollakohtaisesti. ITT:t ovat kaikki satunnaistettuja potilaita, joilla on vähintään 5 hedelmöitettyä munasolua ensimmäisenä päivänä. Joillakin potilailla ei todennäköisesti tapahdu siirtoa blastokystien puutteen tai lasittamiseen/lämpenemiseen liittyvien teknisten ongelmien vuoksi. Siksi analyysi tehdään myös protokollakohtaisesti. Tilastollisissa laskelmissa käytetään logistista regressiota, joka sisältää ositusmuuttujat.