PGS с использованием микроматрицы у пациентов с ЭКО с повторной неудачей имплантации

Актуальность темы Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) является наиболее важным методом лечения бесплодия, независимо от того, является ли его причиной мужское или женское бесплодие, или когда причина неизвестна. Лечение обычно включает перенос в матку оплодотворенной яйцеклетки (эмбриона), культивируемой в течение 2-5 дней. Чтобы выбрать эмбрион с наибольшим шансом на успешную имплантацию в эндометрий, в настоящее время используется микроскопическая оценка для оценки деления эмбриональных клеток, внешнего вида клеток и других факторов. Но этот метод неполноценен, так как не может определить функциональные свойства эмбриона и является ли он генетически нормальным. Известно, что у пар с многочисленными неудачными попытками ЭКО в анамнезе образуется большое количество эмбрионов с аномальным числом хромосом (анеуплоидия), что также характерно для женщин старше 38 лет.

В рамках этого проекта планируется использовать преимплантационный генетический скрининг (ПГС) с методом микрочипов для определения хромосомного состава оплодотворенных яйцеклеток, чтобы при ЭКО переносились только хромосомно нормальные эмбрионы. Цель – повысить вероятность наступления беременности и родов у пар, имеющих в анамнезе неоднократные неудачные попытки ЭКО. Ранее мы провели проспективное рандомизированное исследование с аналогичным вопросом (Ö 612-02) на целевой группе пожилых женщин (> 38 лет) с использованием забора (биопсии) эмбриона на 3-й день культивирования с последующим анализом семи хромосом. пары с использованием техники FISH. Результаты исследования не показали улучшения исхода беременности. Причины, вероятно, таковы: 1) во-первых, нормальные яйца редко встречаются в этой целевой группе; 2) биопсию проводили на 3-й день, когда эмбрион находится на чувствительной стадии; и 3) только 7 из 23 пар хромосом могут быть проанализированы.

Методологические разработки в этой области были быстрыми, и современные технологии позволяют лучше идентифицировать нормальные эмбрионы по сравнению с предыдущим исследованием.

• Мы знаем, что эмбрион менее чувствителен, когда биопсия проводится на 5-й день (стадия бластоцисты), а не на 3-й день.
• При биопсии бластоцисты для диагностики берется больше клеток, чем при биопсии на 3-й день (что повышает надежность анализа).
• Биопсия бластоцисты включает удаление меньшего количества клеток в процентах (3-5%) от общей клеточной массы бластоцисты по сравнению с ранее используемой биопсией на 3-й день, которая включала удаление до 25% от общего числа клеток.
• Бластоцисты имеют более высокую скорость имплантации, чем эмбрионы 3-го дня.
• Сравнительная геномная гибридизация массивов (aCGH) теперь может использоваться с высокой точностью для анализа всех хромосом с использованием коммерческих наборов с контролем качества.
• Криоконсервация с витрификацией бластоцист в настоящее время является весьма успешной методикой, позволяющей проводить анализ без цейтнота.

Кроме того, мы обратимся к группе пациенток, состоящей из женщин с доказанным нормально-хорошим овариальным резервом. В предыдущем исследовании с участием женщин старше 38 лет овариальный резерв был в целом низким.

В подготовительной работе к Закону о генетической целостности говорилось, что PGS следует «зарезервировать для четко определенных исследовательских проектов, одобренных комитетом по этике в ходе этической проверки». Это ограничение было наложено, потому что уровень знаний о PGS в то время был очень ограниченным. Было сочтено, что необходим дополнительный опыт исследовательских проектов по ПГС, чтобы определить, можно ли использовать ПГС в клинической практике. В вышеупомянутой подготовительной работе к Закону о генетической целостности также говорится, что ПГС «может стать важным инструментом для увеличения шансов на беременность в сочетании с лечением ЭКО ...». В этом проекте мы намерены исследовать, можно ли увеличить шансы на беременность и роды у пар, перенесших несколько предыдущих неудачных попыток ЭКО. Наша гипотеза основана на предположении, что неправильное число хромосом часто является основной причиной неудачной имплантации или выкидыша. Для повышения шансов установления беременности, приводящей к родам, мы проводим хромосомный анализ эмбрионов пар, чтобы убедиться, что женщине передаются только эмбрионы с нормальным хромосомным набором.

Вопрос Может ли увеличиться вероятность наступления беременности и родов у пар с несколькими предшествующими неудачными попытками ЭКО, если удастся обеспечить нормальный хромосомный набор у эмбриона до его переноса? В качестве контроля мы сравним результаты попыток ЭКО, когда проводится только световая микроскопия.

Первичная конечная точка: роды на рандомизированную пациентку. Вторичные конечные точки: кумулятивная частота наступления беременности, включая более позднюю передачу оставшихся витрифицированных бластоцист (более высокая частота ожидается в исследуемой группе). Частота выкидышей в течение первых 18 недель беременности (более низкая частота ожидается в исследуемой группе).

Методы и материалы Пациенты Пары с историей как минимум трех неудачных попыток ЭКО, в которых возраст женщины не превышает 39 лет, будут приглашены вместе с их консультацией для нового лечения ЭКО в любой из клиник ЭКО Швеции для участия. в исследовании при условии, что они соответствуют критериям включения (включая ожидаемый нормальный ответ на гормональную стимуляцию 8-10 яйцеклетками). Женщины, согласившиеся участвовать в исследовании, будут рандомизированы (с помощью компьютера) либо в группу биопсии, либо в контрольную группу на следующий день после сбора ооцитов, если у них будет не менее 5 оплодотворенных яйцеклеток (текущая процедура посева на 5-й день).

Критерии включения: пары, которые соответствуют критериям лечения ЭКО и имеют в анамнезе не менее трех предыдущих циклов ЭКО, включая перенос эмбрионов без родов. Возраст женщины на момент проведения исследования может быть не более 39 лет, и она должна иметь нормально-хороший овариальный резерв (не менее 12 антральных фолликулов). Ее партнер должен быть в состоянии предоставить образец спермы, содержащий живую сперму. Женщины, включенные в исследование, не будут участвовать ни в каком другом исследовательском проекте.

Критерии исключения: миома или другие поражения матки, которые, как считается, влияют на имплантацию. Неспецифические кисты, которые не считаются функциональными. Эндометрий >3 см.

Рандомизация

Рандомизация состоится в 1-й день, если пара соответствует требованиям, установленным для посева до стадии бластоцисты (не менее 5 нормально оплодотворенных ооцитов). Программа онлайн-рандомизации (компьютеризированная) будет балансировать следующие параметры:

• Возраст
• Количество полученных ооцитов

Кроме того, во время рандомизации программа рандомизации будет учитывать, что проводится многоцентровое исследование, чтобы избежать систематической ошибки.

Лечение ЭКО Гормональная стимуляция, УЗИ, сбор яйцеклеток и оплодотворение проводятся по стандартной процедуре. Для женщин в контрольной группе все расширенные бластоцисты будут криоконсервированы (витрифицированы) на 5-6 день для последующего переноса. У женщин, рандомизированных для ПГС, клетки (клетки трофэктодермы в наружном клеточном слое эмбриона) будут подвергнуты биопсии на 5-6 день, после чего все бластоцисты, подвергнутые биопсии, будут витрифицированы. Если анализ покажет нормальный хромосомный набор, бластоцисту разморозят и перенесут во время следующего менструального цикла.

Биопсия и лизис клеток Биопсия проводится путем проделывания отверстия в оболочке бластоцисты (zona pellucida) с помощью лазерной техники и специального биопсийного оборудования и удаления 2-5 клеток из наружной клеточной массы (клетки трофобласта). Клетки переносят в пробирку, содержащую раствор PBS. Добавляют экстракционный раствор для лизиса клеток, и ДНК высвобождается в раствор.

Оптимизация амплификации генома Для оптимизации протокола лизиса клеток и амплификации всего генома будут использоваться клетки линии эмбриональных стволовых клеток с трисомией 13, а также клетки с нормальным кариотипом. Три, четыре и пять клеток соответственно будут пипетированы в пробирки для ПЦР. Весь протокол aCGH (см. ниже) будет запущен на этих клетках (не менее 50 пробирок), и результаты будут оценены. Этот подход даст нам представление о чувствительности метода и о том, как часто нам не удается получить результаты из-за неудачной амплификации. Также будут выявлены загрязнения в системе, если они есть.

Массивная сравнительная геномная гибридизация (aCGH) Реагент для амплификации (копирования) ДНК добавляется к экстракту ДНК. Амплификацию проводят в несколько этапов с использованием методики, называемой «полимеразной цепной реакцией» (ПЦР). Этот процесс требует большой точности и специального лабораторного оборудования, чтобы чужеродная ДНК не загрязняла образец. Загрязнение на этом этапе может привести к неправильной диагностике строения хромосом эмбрионов. Затем амплифицированную ДНК метят флуоресцентной молекулой, которая заставляет ДНК флуоресцировать зеленым цветом при УФ-освещении. Точно так же нормальная контрольная ДНК помечена молекулой, которая флуоресцирует красным цветом в УФ-освещении. Амплифицированную флуоресцентно меченную ДНК смешивают с равным объемом нормальной флуоресцентно меченной контрольной ДНК. Эта смесь ДНК наносится на тестовые поверхности с определенными последовательностями ДНК. Эти последовательности ДНК тщательно отбираются и размещаются на тестовых поверхностях в виде длинных массивов в определенном порядке, что означает, что ДНК со всех плеч хромосом представлена ​​на тестовой поверхности в определенных местах. На этапе гибридизации ДНК в смеси ДНК будет конкурировать за связывание с ДНК на тестовой поверхности. Если имеется равное количество амплифицированной ДНК (зеленый) и контрольной ДНК (красный), то равное количество ДНК из обеих фракций будет связываться с тестовой поверхностью. После гибридизации, когда тестовая поверхность освещается УФ-светом, зеленая и красная флуоресценция будут одинаково интенсивными, что приводит к оранжевому цвету (смесь с равными частями красного и зеленого цвета). Однако, если у эмбриона имеется избыток ДНК из данной хромосомы (например, трисомия), большее количество последовательностей ДНК из этой хромосомы будет связываться с тестовой поверхностью, что приведет к избытку зеленой флуоресценции в области тестовой поверхности, содержащей последовательности ДНК соответствующей хромосомы. Точно так же потеря хромосомы у эмбриона приводит к нехватке соответствующей ДНК в амплифицированной фракции, в результате чего большее количество контрольных последовательностей ДНК (красные) связываются с тестовой поверхностью. Области тестирования сканируются, и результаты автоматически обрабатываются компьютеризированным сканером.

Классификация эмбрионов:

Оценку и классификацию бластоцист проводят в соответствии с принятой классификацией по Гарднеру, в которой оценивают степень экспансии, плотность клеток и количество клеток во внутренней клеточной массе (ВК) и в трофэктодерме (ТЭ). Все бластоцисты в контрольной группе будут витрифицированы для последующего переноса. Аналогичная оценка будет проведена в группе биопсии до биопсии. После биопсии все биопсийные бластоцисты будут витрифицированы.

В группе, в которой проводится биопсия, будет проведен микрочиповый анализ. Перенос делается во время естественного менструального цикла через 5 дней после овуляции. Женщинам с гормональными нарушениями перед переносом витрифицированной/нагретой бластоцисты требуется легкая гормональная стимуляция.

Витрификация После биопсии бластоцисты их витрифицируют, а затем размораживают в соответствии с общепринятым в клиниках протоколом.

Последующее наблюдение Первичной конечной точкой является рождение каждого рандомизированного пациента. Вторичными конечными точками являются кумулятивная частота наступления беременности, поскольку также переносятся дополнительные криоконсервированные бластоцисты (если таковые имеются), а также частота выкидышей в течение первых 18 недель беременности (в исследуемой группе ожидается более низкая частота). Мы планируем создать Совет по мониторингу безопасности данных (DSMB), состоящий из независимых внешних экспертов, когда половина исследования будет завершена.

Наблюдение за всеми беременностями и родами будет осуществляться в соответствии с действующей процедурой в рамках ЭКО.

Статистический анализ мощности показал, что для выявления значимой разницы в исходах беременности от расчетных 15% в контрольной группе до 40% в группе ПГС необходимо 112 пациенток (альфа=0,8; бета=0,20). Предполагаемый уровень отсева около 10% и запланированный анализ DSMB означают, что необходимо набрать 130 пациентов. DSMB будет следить за исследованием и периодически давать рекомендации о том, следует ли нам продолжать исследование. Анализ DSMB даст 3 рекомендации: (1) продолжить исследование в соответствии с планом, (2) прекратить исследование, если разница между группами составляет менее 15 %, (3) продолжить исследование с большим размером выборки. Когда разница между группами составляет 20 % и более, исследование можно продолжить с большим размером выборки (73 пациента в каждой группе). власть. DSMB может оценить как живорождение, так и текущую беременность и взвесить всю информацию, когда они дадут рекомендацию. DSMB будет состоять из специалистов, имеющих опыт работы в этой области. Статистические расчеты будут проводиться в соответствии с намерением лечить (ITT), а также в соответствии с протоколом. ITT — все рандомизированные пациентки, имеющие не менее 5 оплодотворенных ооцитов в 1-й день. У некоторых пациентов, вероятно, не будет переноса из-за отсутствия бластоцист или технических проблем, связанных с витрификацией/согреванием и т. д. Поэтому анализ также будет проводиться по протоколу. Логистическая регрессия будет использоваться в статистических расчетах и ​​включать переменные стратификации.