PGS pomocí Microarray u pacientů s IVF s opakovaným selháním implantace

Pozadí In vitro fertilizace (IVF) je nejdůležitější metodou k nápravě neplodnosti, ať už je její příčinou muž nebo žena, nebo když je příčina neznámá. Léčba obvykle zahrnuje přenos oplodněného vajíčka (embrya), které bylo kultivováno po dobu 2-5 dnů, do dělohy. Pro výběr embrya s největší šancí na úspěšnou implantaci do endometria se v současnosti používá mikroskopické hodnocení ke klasifikaci embryonálního buněčného dělení, buněčného vzhledu a dalších faktorů. Tato metoda je ale neúplná, protože nedokáže určit funkční vlastnosti embrya nebo zda je geneticky normální. Je známo, že páry s historií více neúspěšných IVF léčeb produkují velké množství embryí, která mají abnormální počet chromozomů (aneuploidie), což je také běžné u žen starších 38 let.

Tento projekt má v úmyslu využít preimplantační genetický screening (PGS) s technikou microarray ke stanovení chromozomového složení oplodněných vajíček tak, aby se během IVF přenášela pouze chromozomálně normální embrya. Účelem je zvýšit pravděpodobnost otěhotnění a porodu u párů s anamnézou opakovaných neúspěšných pokusů o IVF. Již dříve jsme provedli prospektivní randomizovanou studii s podobnou otázkou (Ö 612-02) na cílové skupině starších žen (>38 let) s použitím odběru (biopsie) embrya 3. den kultivace s následnou analýzou sedmi chromozomů páry pomocí techniky FISH. Výsledky studie neprokázaly žádné zlepšení výsledku těhotenství. Důvody jsou pravděpodobně 1) pro začátek, normální vejce jsou u této cílové skupiny vzácná; 2) biopsie byla provedena 3. den, kdy je embryo v citlivém stádiu; a 3) mohlo být analyzováno pouze 7 z celkového počtu 23 párů chromozomů.

Metodologický vývoj v této oblasti byl rychlý a současná technologie umožňuje lepší identifikaci normálních embryí ve srovnání s předchozí studií.

• Víme, že embryo je méně citlivé, když se biopsie provede 5. den (stadia blastocysty) místo 3. dne.
• Při biopsii blastocysty se pro diagnostiku odebere více buněk než při biopsii 3. dne (čímž se zvyšuje spolehlivost analýzy).
• Biopsie blastocysty zahrnuje odstranění menšího počtu buněk na procentuálním základě (3–5 %) z celkové buněčné hmoty blastocysty ve srovnání s dříve používanou biopsií 3. dne, která zahrnovala odstranění až 25 % z celkového počtu buněk.
• Blastocysty mají vyšší míru implantace než embrya 3. dne.
• Porovnávací genomická hybridizace (aCGH) může být nyní použita s velkou přesností k analýze všech chromozomů pomocí komerčních souprav s kontrolovanou kvalitou.
• Kryokonzervace s vitrifikací blastocyst je v současnosti velmi úspěšná technika, která umožňuje provádět analýzu bez časové tísně.

Kromě toho se obrátíme na pacientskou skupinu složenou z žen s prokázanou normální-dobrou ovariální rezervou. V předchozí studii zahrnující ženy > 38 let byla ovariální rezerva obecně nízká.

V přípravných pracích pro zákon o genetické integritě bylo uvedeno, že PGS by mělo být „vyhrazeno pro jasně definované výzkumné projekty schválené etickou komisí v rámci etického přezkumu“. Toto omezení bylo uloženo, protože stav znalostí o PGS byl v té době velmi omezený. Bylo považováno za nezbytné získat více zkušeností z výzkumných projektů o PGS, aby bylo možné určit, zda lze PGS použít v klinické praxi. Výše zmíněná přípravná práce pro zákon o genetické integritě také uvádí, že PGS „se může stát důležitým nástrojem pro zvýšení šancí na otěhotnění ve spojení s léčbou IVF...“. V tomto projektu hodláme prozkoumat, zda je možné zvýšit šanci na otěhotnění a porod u párů, které podstoupily několik předchozích neúspěšných pokusů IVF. Naše hypotéza je založena na předpokladu, že nesprávný počet chromozomů je často základní příčinou neúspěšné implantace nebo potratu. Abychom zvýšili šance na otěhotnění vedoucí k porodu, provádíme chromozomální analýzu embryí párů, abychom zajistili, že ženě budou přenesena pouze embrya s normální sadou chromozomů.

Otázka Může se pravděpodobnost otěhotnění a porodu u párů s několika předchozími neúspěšnými pokusy IVF zvýšit, pokud lze v embryu před přenosem zajistit normální sadu chromozomů? Jako kontrolu porovnáme výsledky pokusů IVF, kde se provádí pouze hodnocení světelným mikroskopem.

Primární cílový bod: Porod na randomizovaného pacienta Sekundární cíle: Kumulativní četnost těhotenství včetně pozdějšího přenosu zbývajících vitrifikovaných blastocyst (vyšší četnost se očekává ve studijní skupině). Míra potratů během prvních 18 týdnů těhotenství (nižší míra očekávaná ve studijní skupině).

Metody a materiály Pacienti Páry s anamnézou alespoň tří neúspěšných pokusů IVF, ve kterých je ženě maximálně 39 let, budou pozvány spolu s konzultací o nové léčbě IVF na kterékoli z klinik IVF ve Švédsku k účasti ve studii za předpokladu, že splňují kritéria pro zařazení (včetně očekávané normální reakce na hormonální stimulaci s 8-10 vajíčky). Ženy, které souhlasí s účastí ve studii, budou randomizovány (počítačem) buď do biopsie nebo do kontrolní skupiny den po odběru oocytů, pokud mají alespoň 5 oplozených vajíček (současný postup kultivace 5. den).

Kritéria pro zařazení: Páry, které splňují kritéria pro léčbu IVF a které mají v anamnéze alespoň tři předchozí cykly IVF včetně přenosu embrya bez porodu. V době provádění studie může být ženě maximálně 39 let a musí mít normální-dobrou ovariální rezervu (alespoň 12 antrálních folikulů). Její partner musí být schopen poskytnout vzorek spermatu obsahující živé spermie. Ženy zahrnuté do studie se nebudou účastnit žádného jiného výzkumného projektu.

Kritéria vyloučení: Myom nebo jiné děložní léze, u kterých se předpokládá, že ovlivňují implantaci. Nespecifické cysty, které nejsou považovány za funkční. Endometrium > 3 cm.

Randomizace

Randomizace se uskuteční 1. den, pokud pár splní požadavky stanovené pro kultivaci do stadia blastocysty (alespoň 5 normálně oplodněných oocytů). On-line randomizační program (počítačový) vyrovná následující parametry:

• Stáří
• Počet získaných oocytů

Navíc v době randomizace bude randomizační program brát v úvahu, že je zahrnuta multicentrická studie, aby se předešlo zkreslení.

IVF léčba Standardním postupem bude hormonální stimulace, ultrazvukové kontroly, odběr oocytů a oplodnění. U žen v kontrolní skupině budou všechny expandované blastocysty kryokonzervovány (vitrifikovány) 5. až 6. den pro pozdější přenos. U žen randomizovaných do PGS budou buňky (buňky trofektodermu ve vnější buněčné vrstvě embrya) odebrány biopsii v den 5-6, poté budou všechny biopsie blastocysty vitrifikovány. Pokud analýza ukáže normální sadu chromozomů, bude blastocysta rozmražena a přenesena během dalšího menstruačního cyklu.

Biopsie a lýza buněk Biopsie se provádí vytvořením otvoru ve skořápce blastocysty (zona pellucida) pomocí laserové technologie a speciálního bioptického zařízení a odstraněním 2-5 buněk z vnější buněčné hmoty (buňky trofoblastu). Buňky se přenesou do zkumavky obsahující roztok PBS. K lýze buněk se přidá extrakční roztok a do roztoku se uvolní DNA.

Optimalizace amplifikace genomu K optimalizaci protokolu pro buněčnou lýzu a amplifikaci celého genomu budou použity buňky z linie embryonálních kmenových buněk s trizomií 13 a také z normálního karyotypu. Do PCR zkumavek bude pipetováno tři, čtyři a pět buněk. Na těchto buňkách (nejméně 50 zkumavek) bude spuštěn celý protokol aCGH (viz níže) a výsledky budou vyhodnoceny. Tento přístup nám poskytne představu o citlivosti metody a o tom, jak často se nám nepodaří získat výsledky kvůli neúspěšné amplifikaci. Případná kontaminace v systému bude také odhalena.

Pole Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Reagent pro amplifikaci (kopírování) DNA se přidá k extraktu DNA. Amplifikace se provádí v několika krocích za použití techniky zvané "polymerázová řetězová reakce" (PCR). Tento proces vyžaduje velkou přesnost a speciální laboratorní vybavení, aby cizí DNA nekontaminovala vzorek. Kontaminace v tomto kroku by mohla vést k nesprávné diagnóze chromozomové konstituce embryí. Amplifikovaná DNA je poté značena fluorescenční molekulou, která způsobí, že DNA bude pod UV osvětlením zeleně fluoreskovat. Podobně je normální kontrolní DNA označena molekulou, která pod UV osvětlením červeně fluoreskuje. Amplifikovaná fluorescenčně značená DNA se smíchá se stejným objemem normální fluorescenčně značené kontrolní DNA. Tato směs DNA se aplikuje na testovací povrchy se specifickými sekvencemi DNA. Tyto sekvence DNA jsou pečlivě vybrány a umístěny na testovací povrchy v dlouhých polích ve specifickém pořadí, což znamená, že DNA ze všech ramen chromozomu je zastoupena na testovacím povrchu na konkrétních místech. Během hybridizačního kroku bude DNA ve směsi DNA soutěžit o vazbu na DNA na testovacím povrchu. Pokud jsou stejná množství amplifikované DNA (zelená) a kontrolní DNA (červená), pak se na testovací povrch naváže stejné množství DNA z obou frakcí. Po hybridizaci, kdy je testovací povrch osvětlen UV světlem, bude zelená a červená fluorescence stejně intenzivní, což vede k oranžové barvě (směs se stejnými podíly červené a zelené barvy). Pokud je však v embryu přebytek DNA z daného chromozomu (např. trizomie), naváže se na testovací povrch více sekvencí DNA z tohoto chromozomu, což má za následek přebytek zelené fluorescence v oblasti na testovacím povrchu obsahující sekvence DNA z příslušného chromozomu. Podobně ztráta chromozomu v embryu vede k nedostatku odpovídající DNA v amplifikované frakci, což způsobí, že se na testovací povrch naváže více kontrolních sekvencí DNA (červená). Testovací oblasti jsou naskenovány a výsledky zpracovány automaticky v počítačovém skeneru.

Klasifikace embryí:

Hodnocení a klasifikace blastocyst bude provedena v souladu s přijatou klasifikací podle Gardnera, ve které se posuzuje stupeň expanze, hustota buněk a počet buněk ve vnitřní buněčné hmotě (IC) a v trofektodermu (TE). Všechny blastocysty v kontrolní skupině budou vitrifikovány pro pozdější přenos. Podobné hodnocení bude provedeno ve skupině biopsie před biopsií. Po biopsii budou všechny bioptické blastocysty vitrifikovány.

Ve skupině, ve které se provádí biopsie, bude provedena mikročipová analýza. Přenos se provádí během přirozeného menstruačního cyklu 5 dní po ovulaci. Ženy s hormonální poruchou vyžadují před přenosem vitrifikované/zahřáté blastocysty mírnou hormonální stimulaci.

Vitrifikace Po biopsii budou blastocysty vitrifikovány a následně rozmraženy podle dobře zavedeného protokolu na klinikách.

Sledování Primárním cílovým parametrem je porod na randomizovaného pacienta. Sekundárními cílovými parametry jsou kumulativní míra těhotenství, protože jsou také přeneseny extra kryokonzervované blastocysty (pokud existují), a míra potratů během prvních 18 týdnů těhotenství (nižší míra očekávaná ve studijní skupině). Po dokončení poloviny studie plánujeme vytvořit Výbor pro monitorování bezpečnosti dat (DSMB) složený z nezávislých externích odborníků.

Sledování všech těhotenství a porodů bude probíhat podle aktuálního postupu v rámci IVF.

Statistika Analýza síly ukázala, že k detekci významného rozdílu ve výsledcích těhotenství od odhadovaných 15 % v kontrolní skupině po 40 % ve skupině PGS je zapotřebí 112 pacientek (alfa=0,8; Beta=0,20). Odhadovaná míra opotřebení asi 10 % a plánovaná analýza DSMB znamenají, že by mělo být přijato 130 pacientů. DSMB bude studii monitorovat a poskytovat pravidelné rady, zda bychom měli ve studii pokračovat. Analýza DSMB poskytne 3 doporučení: (1) pokračovat ve studii podle plánu, (2) zastavit studii, pokud je rozdíl mezi skupinami menší než 15 %, (3) pokračovat ve studii s větší velikostí vzorku. Když je rozdíl mezi skupinami 20 % nebo větší, studie může pokračovat s větší velikostí vzorku (73 pacientů v každé skupině Analýza DSMB doporučí pokračovat ve studii nebo ji zastavit (kvůli vysoce významnému účinku, negativnímu účinku nebo nízké podmíněnosti Napájení. DSMB může vyhodnotit jak živé porody, tak probíhající těhotenství a zvážit všechny informace, když dají doporučení. DSMB se bude skládat ze specialistů, kteří mají v této oblasti zkušenosti. Statistické výpočty budou provedeny podle záměru léčby (ITT) a také podle protokolu. ITT jsou všichni randomizovaní pacienti, kteří mají alespoň 5 oplodněných oocytů v den 1. Někteří pacienti pravděpodobně nebudou mít žádný přenos kvůli nedostatku blastocyst nebo technickým problémům souvisejícím s vitrifikací / oteplováním atd. Proto bude analýza také provedena podle protokolu. Ve statistických výpočtech bude použita logistická regrese a bude zahrnovat stratifikační proměnné.