반복적인 이식 실패가 있는 IVF 환자에서 마이크로어레이를 사용한 PGS

배경 체외 수정(IVF)은 원인이 남성이든 여성이든, 또는 원인을 알 수 없는 경우 불임 치료에 가장 중요한 방법입니다. 치료는 일반적으로 2~5일 동안 배양된 수정란(배아)을 자궁으로 이식하는 것입니다. 자궁내막에 성공적으로 착상할 가능성이 가장 높은 배아를 선택하기 위해 현미경 평가는 현재 배아 세포 분열, 세포 모양 및 기타 요인의 등급을 매기는 데 사용됩니다. 그러나 이 방법은 배아의 기능적 특성이나 유전적으로 정상인지 여부를 판단할 수 없기 때문에 불완전하다. 여러 번의 IVF 치료에 실패한 이력이 있는 부부는 비정상적인 염색체 수(이수성)를 가진 배아를 많이 생산하는 것으로 알려져 있으며, 이는 38세 이상의 여성에게도 일반적입니다.

이 프로젝트는 수정란의 염색체 구성을 결정하기 위해 마이크로어레이 기술과 함께 착상 전 유전자 스크리닝(preimplantation genetic screening, PGS)을 사용하여 체외수정 시 염색체가 정상인 배아만 이식할 계획입니다. 체외수정 시도가 반복적으로 실패한 이력이 있는 부부의 임신과 출산 확률을 높이는 것이 목적이다. 우리는 이전에 배양 3일차에 배아의 샘플링(생검)을 사용하여 7개 염색체 FISH 기술을 사용하여 쌍을 이룹니다. 연구 결과는 임신 결과에 개선이 없는 것으로 나타났습니다. 그 이유는 아마도 1) 우선, 이 대상 그룹에서 정상적인 계란이 드물다는 것입니다. 2) 배아가 민감한 단계에 있는 3일째 생검을 수행하였다; 3) 총 23개의 염색체 쌍 중 7개만 분석할 수 있었습니다.

이 분야의 방법론적 발전은 급속했고 현재의 기술은 이전 연구에 비해 정상 배아를 더 잘 식별할 수 있게 합니다.

• 생검이 3일차가 아닌 5일차(배반포 단계)에 수행될 때 배아가 덜 민감하다는 것을 알고 있습니다.
• 배반포 생검에서는 3일 생검보다 진단을 위해 더 많은 세포를 제거합니다(따라서 분석의 신뢰성을 높임).
• 배반포 생검은 총 세포 수의 25%까지 제거하는 이전에 사용된 3일 생검과 비교하여 배반포의 총 세포 질량에서 백분율 기준(3-5%)으로 더 적은 수의 세포를 제거하는 것을 포함합니다.
• 배반포는 3일차 배아보다 착상률이 더 높습니다.
• Array Comparative Genomic Hybridization(aCGH)은 이제 상용 품질 관리 키트를 사용하여 모든 염색체를 분석하는 데 매우 정밀하게 사용할 수 있습니다.
• 배반포의 유리화를 통한 동결 보존은 현재 시간에 쫓기지 않고 분석을 수행할 수 있는 매우 성공적인 기술입니다.

또한 정상-양호한 난소 보유력이 입증된 여성으로 구성된 환자 그룹으로 전환할 것입니다. 38세 이상의 여성을 대상으로 한 이전 연구에서 난소 예비력은 일반적으로 좋지 않았습니다.

Genetic Integrity Act의 준비 작업은 PGS가 "윤리 위원회의 윤리적 검토에서 승인된 명확하게 정의된 연구 프로젝트를 위해 유보되어야 한다"고 명시했습니다. 이 제한은 당시 PGS에 대한 지식 상태가 매우 제한적이었기 때문에 부과되었습니다. PGS가 임상 실습에 사용될 수 있는지 여부를 결정하려면 PGS에 대한 연구 프로젝트에서 더 많은 경험이 필요하다고 생각되었습니다. 위에서 언급한 Genetic Integrity Act의 준비 작업은 또한 PGS가 "IVF 치료와 함께 임신 가능성을 높이는 중요한 도구가 될 수 있습니다..."라고 말합니다. 이 프로젝트에서는 이전에 여러 번의 IVF 시도에 실패한 부부를 대상으로 임신과 출산의 기회를 높일 수 있는지 여부를 조사하려고 합니다. 우리의 가설은 잘못된 수의 염색체가 종종 착상 실패 또는 유산의 근본 원인이라는 가정에 근거합니다. 출산으로 이어지는 임신확률을 높이기 위해 부부의 배아를 대상으로 염색체 분석을 진행하여 정상적인 염색체 세트를 가진 배아만이 여성에게 전달되도록 하고 있습니다.

질문 이전에 여러 번의 IVF 시도에 실패한 부부의 임신 및 출산 확률이 이식되기 전에 배아에서 정상적인 염색체 세트를 보장할 수 있다면 증가할 수 있습니까? 통제로서 광학 현미경 평가만 수행되는 IVF 시도의 결과를 비교할 것입니다.

1차 종점: 무작위 환자당 분만 2차 종점: 남아있는 유리화된 배반포의 추후 이식을 포함한 누적 임신률(연구 그룹에서 더 높은 비율이 예상됨). 임신 첫 18주 동안의 유산율(연구 그룹에서 예상되는 낮은 비율).

방법 및 재료 환자 IVF 시도가 최대 39세 이상이고 IVF 시도가 3회 이상 실패한 커플은 IVF Sweden 클리닉 중 하나에서 새로운 IVF 치료에 대한 상담과 함께 참여하도록 초대됩니다. 포함 기준(8-10개의 알로 호르몬 자극에 대한 예상되는 정상적인 반응 포함)을 충족하는 경우 연구에서. 연구 참여에 동의한 여성은 수정란이 5개 이상인 경우 난모세포 수집 다음 날 생검 또는 대조군으로 무작위 배정됩니다(현재 배양 절차는 5일째).

포함 기준: IVF 치료 기준을 충족하고 분만 없이 배아 이식을 포함하여 이전 IVF 주기가 최소 3회 이력이 있는 부부. 연구가 수행될 때 여성은 최대 39세일 수 있으며 정상-양호한 난소 예비력(적어도 12개의 전정부 난포)을 가져야 합니다. 그녀의 파트너는 살아 있는 정자가 포함된 정액 샘플을 제공할 수 있어야 합니다. 연구에 포함된 여성은 다른 연구 프로젝트에 참여하지 않습니다.

제외 기준: 근종 또는 착상에 영향을 미치는 것으로 판단되는 기타 자궁 병변. 기능적인 것으로 간주되지 않는 비특이적 낭종. 자궁내막>3 cm.

무작위화

부부가 배반포 단계까지의 배양을 위해 설정된 요구 사항을 충족하는 경우(적어도 5개의 정상적으로 수정된 난모세포) 1일에 무작위 배정이 이루어집니다. 온라인 무작위화 프로그램(컴퓨터화)은 다음 매개변수의 균형을 맞춥니다.

• 나이
• 검색된 난모세포의 수

또한 무작위화 시 무작위화 프로그램은 편견을 피하기 위해 다기관 연구가 포함된다는 점을 고려할 것입니다.

IVF 치료 호르몬 자극, 초음파 검사, 난자 수집 및 수정은 표준 절차를 따릅니다. 대조군에 있는 여성의 경우, 확장된 모든 배반포는 차후 이송을 위해 5-6일째에 동결보존(유리화)됩니다. PGS에 무작위 배정된 여성의 경우, 세포(배아의 외부 세포층에 있는 영양외배엽 세포)를 5-6일째 생검한 후 모든 생검 배반포를 유리화합니다. 분석 결과 정상적인 염색체 세트가 표시되면 배반포는 해동되어 다음 월경 주기 동안 옮겨집니다.

생검 및 세포 용해 생검은 레이저 기술과 특수 생검 장비를 사용하여 배반포 껍질(투명대)에 구멍을 뚫고 외부 세포 덩어리(영양막 세포)에서 2-5개의 세포를 제거하여 수행됩니다. 세포를 PBS 용액이 들어 있는 시험관으로 옮긴다. 추출 용액을 첨가하여 세포를 용해시키고 DNA를 용액으로 방출합니다.

게놈 증폭의 최적화 세포 용해 및 전체 게놈 증폭을 위한 프로토콜을 최적화하기 위해 정상 핵형뿐만 아니라 삼염색체성 13을 가진 배아 줄기 세포주의 세포가 사용됩니다. 3개, 4개 및 5개의 세포를 각각 PCR 튜브에 피펫팅합니다. 전체 aCGH 프로토콜(아래 참조)이 이러한 세포(최소 50개의 튜브)에서 실행되고 결과가 평가됩니다. 이 접근법은 방법의 민감도와 증폭 실패로 인해 결과를 얻지 못하는 빈도에 대한 아이디어를 제공합니다. 시스템의 오염도(있는 경우) 드러날 것입니다.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) DNA 증폭(복사) 시약을 DNA 추출물에 첨가합니다. 증폭은 "Polymerase Chain Reaction"(PCR)이라는 기술을 사용하여 여러 단계로 수행됩니다. 이 프로세스에는 외부 DNA가 샘플을 오염시키지 않도록 높은 정확도와 특수 실험실 시설이 필요합니다. 이 단계에서의 오염은 배아의 염색체 구성에 대한 오진으로 이어질 수 있습니다. 증폭된 DNA는 UV 조명 하에서 DNA가 녹색 형광을 발하도록 하는 형광 분자로 표지됩니다. 유사하게, 정상 대조군 DNA는 UV 조명 하에서 적색 형광을 발하는 분자로 표지됩니다. 증폭된 형광 표지된 DNA는 동일한 부피의 일반 형광 표지된 대조군 DNA와 혼합됩니다. 이 DNA 혼합물은 특정 DNA 서열을 가진 테스트 표면에 적용됩니다. 이러한 DNA 시퀀스는 신중하게 선택되어 특정 순서로 긴 배열로 테스트 표면에 배치됩니다. 즉, 모든 염색체 팔의 DNA가 테스트 표면의 특정 위치에 표시됩니다. 혼성화 단계 동안 DNA 혼합물의 DNA는 테스트 표면의 DNA에 결합하기 위해 경쟁합니다. 증폭된 DNA(녹색)와 대조군 DNA(빨간색)의 양이 같으면 두 분획의 DNA가 같은 양으로 테스트 표면에 결합합니다. 혼성화 후 테스트 표면에 UV 광을 비추면 녹색과 적색 형광이 동등하게 강렬하여 주황색(적색과 녹색의 동일한 부분이 혼합된 혼합물)이 됩니다. 그러나 배아에 주어진 염색체의 DNA가 과잉인 경우(예: 삼염색체성) 이 염색체의 더 많은 DNA 서열이 시험 표면에 결합하여 관련 염색체의 DNA 서열. 마찬가지로, 배아에서 염색체가 손실되면 증폭된 분획에서 해당 DNA가 부족하여 더 많은 제어 DNA 서열(빨간색)이 테스트 표면에 결합하게 됩니다. 테스트 영역이 스캔되고 결과는 컴퓨터 스캐너에서 자동으로 처리됩니다.

배아 등급:

배반포의 평가 및 등급화는 팽창 정도, 세포 밀도, 내부 세포 덩어리(IC) 및 영양외배엽(TE)의 세포 수를 평가하는 Gardner에 따른 허용된 분류에 따라 수행됩니다. 대조군의 모든 배반포는 나중에 옮기기 위해 유리화됩니다. 유사한 평가가 생검 전에 생검 그룹에서 수행될 것입니다. 생검 후, 모든 생검된 배반포는 유리화될 것입니다.

생검이 수행되는 그룹에서 마이크로어레이 분석이 수행됩니다. 이식은 배란 5일 후 자연 월경 주기 동안 이루어집니다. 호르몬 장애가 있는 여성은 유리화/따뜻한 배반포를 옮기기 전에 가벼운 호르몬 자극이 필요합니다.

유리화 배반포를 생검한 후 유리화한 다음 클리닉에서 확립된 프로토콜에 따라 해동합니다.

후속 조치 1차 종점은 무작위 환자당 출생입니다. 2차 종료점은 추가 동결보존 배반포(있는 경우)도 이전되기 때문에 누적 임신율과 임신 첫 18주 동안의 유산율(연구 그룹에서 더 낮은 비율이 예상됨)입니다. 연구의 절반이 완료되면 독립적인 외부 전문가로 구성된 데이터 안전 모니터링 위원회(DSMB)를 구성할 계획입니다.

모든 임신 및 출산에 대한 후속 조치는 체외수정의 현재 절차에 따라 수행됩니다.

Statistics Power 분석은 대조군의 약 15%에서 PGS 그룹의 40%까지 임신 결과의 유의미한 차이를 감지하려면 112명의 환자(알파=0.8; 베타=0.20). 약 10%의 예상 감소율과 계획된 DSMB 분석은 130명의 환자를 모집해야 함을 의미합니다. DSMB는 연구를 모니터링하고 연구를 계속해야 하는지 여부에 대한 정기적인 조언을 제공할 것입니다. DSMB 분석은 3가지 권장 사항을 제공합니다. (1) 계획대로 연구를 계속합니다. (2) 그룹 간의 차이가 15% 미만이면 연구를 중단합니다. (3) 더 큰 샘플 크기로 연구를 계속합니다. 그룹 간 차이가 20% 이상인 경우 더 큰 샘플 크기로 연구를 계속할 수 있습니다(각 그룹당 73명의 환자). DSMB 분석은 연구를 계속하거나 중단하도록 조언합니다(높은 유의미한 효과, 부정적인 영향 또는 낮은 조건부 힘. DSMB는 정상 출산과 진행 중인 임신을 모두 평가하고 권장 사항을 제공할 때 모든 정보의 무게를 잴 수 있습니다. DSMB는 이 분야에서 경험이 풍부한 전문가들로 구성될 것입니다. 통계 계산은 ITT(intention-to-treat) 및 프로토콜에 따라 수행됩니다. ITT는 1일차에 적어도 5개의 수정된 난모세포를 갖는 모든 무작위 환자입니다. 일부 환자는 배반포가 부족하거나 유리화/온난화 등과 관련된 기술적 문제로 인해 이식되지 않을 가능성이 있습니다. 따라서 프로토콜별로 분석도 수행됩니다. 로지스틱 회귀는 통계 계산에 사용되며 층화 변수를 포함합니다.