PGS met behulp van Microarray bij IVF-patiënten met herhaalde implantatiefouten

Achtergrond In-vitrofertilisatie (IVF) is de belangrijkste methode om onvruchtbaarheid te verhelpen, of de oorzaak nu bij de man of de vrouw ligt, of wanneer de oorzaak onbekend is. De behandeling omvat meestal de overdracht naar de baarmoeder van een bevruchte eicel (embryo) die gedurende 2-5 dagen is gekweekt. Om het embryo te selecteren met de beste kans op succesvolle implantatie in het endometrium, wordt momenteel microscopische evaluatie gebruikt om de embryonale celdeling, het cellulaire uiterlijk en andere factoren te beoordelen. Maar deze methode is onvolledig omdat het niet de functionele eigenschappen van het embryo kan bepalen, of dat het genetisch normaal is. Het is bekend dat paren met een voorgeschiedenis van meerdere mislukte IVF-behandelingen een groot aantal embryo's produceren met een abnormaal aantal chromosomen (aneuploïdie), wat ook vaak voorkomt bij vrouwen ouder dan 38 jaar.

Dit project beoogt door middel van pre-implantatie genetische screening (PGS) met de microarray-techniek de chromosoomsamenstelling van bevruchte eicellen te bepalen, zodat bij IVF alleen chromosomaal normale embryo's worden teruggeplaatst. Het doel is om de kans op zwangerschap en bevalling te vergroten bij paren met een geschiedenis van herhaalde mislukte IVF-pogingen. We hebben eerder een prospectieve gerandomiseerde studie uitgevoerd met een vergelijkbare vraag (Ö 612-02) op een doelgroep van oudere vrouwen (>38 jaar) met behulp van bemonstering (biopsie) van het embryo op dag 3 van de kweek, gevolgd door analyse van zeven chromosomen paren met behulp van de FISH-techniek. De resultaten van de studie toonden geen verbetering in de uitkomst van de zwangerschap. De redenen zijn waarschijnlijk 1) om te beginnen zijn normale eieren zeldzaam in deze doelgroep; 2) de biopsie werd uitgevoerd op dag 3 wanneer het embryo zich in een gevoelig stadium bevindt; en 3) slechts 7 van de in totaal 23 chromosoomparen konden worden geanalyseerd.

De methodologische ontwikkelingen in het veld zijn snel gegaan en de huidige technologie maakt een betere identificatie van normale embryo's mogelijk in vergelijking met de vorige studie.

• We weten dat het embryo minder gevoelig is wanneer een biopsie wordt uitgevoerd op dag 5 (van het blastocyststadium) in plaats van op dag 3.
• Bij een blastocystbiopsie worden meer cellen verwijderd voor diagnose dan bij een biopsie op dag 3 (waardoor de betrouwbaarheid van de analyse toeneemt).
• Blastocyst-biopsie omvat het verwijderen van minder cellen op procentuele basis (3-5%) van de totale celmassa van de blastocyst in vergelijking met de eerder gebruikte biopsie van dag 3, waarbij tot 25% van het totale aantal cellen werd verwijderd.
• Blastocysten hebben een hogere implantatiesnelheid dan embryo's van dag 3.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) kan nu met grote precisie worden gebruikt om alle chromosomen te analyseren met behulp van commerciële, op kwaliteit gecontroleerde kits.
• Cryopreservatie met vitrificatie van blastocysten is momenteel een zeer succesvolle techniek waarmee de analyse zonder tijdsdruk kan worden uitgevoerd.

Daarnaast richten we ons op een patiëntengroep bestaande uit vrouwen met een bewezen normaal-goede ovariële reserve. In de vorige studie met vrouwen >38 jaar was de ovariële reserve over het algemeen slecht.

In het voorbereidende werk voor de Genetic Integrity Act stond dat PGS "moet worden gereserveerd voor duidelijk omschreven onderzoeksprojecten die zijn goedgekeurd in een ethische toetsing door een ethische commissie". Deze beperking is opgelegd omdat de kennis over PGS op dat moment zeer beperkt was. Meer ervaring uit onderzoeksprojecten over PGS werd nodig geacht om te bepalen of PGS in de klinische praktijk zou kunnen worden gebruikt. In het bovengenoemde voorbereidende werk voor de Wet Genetische Integriteit staat ook dat PGS "een belangrijk instrument kan worden om de kans op zwangerschap te vergroten in combinatie met een IVF-behandeling ...". In dit project willen we onderzoeken of het mogelijk is om de kans op zwangerschap en bevalling te vergroten bij paren die meerdere eerdere mislukte IVF-pogingen hebben ondergaan. Onze hypothese is gebaseerd op de veronderstelling dat een onjuist aantal chromosomen vaak de onderliggende oorzaak is van een mislukte implantatie of een miskraam. Om de kans op een zwangerschap die leidt tot een bevalling te vergroten, voeren we een chromosoomanalyse uit op de embryo's van paren om ervoor te zorgen dat alleen embryo's met een normale chromosoomset worden teruggeplaatst naar de vrouw.

Vraag Kan de kans op zwangerschap en bevalling bij paren met meerdere eerdere mislukte IVF-pogingen toenemen als een normale chromosoomzetting in het embryo kan worden verzekerd voordat het wordt teruggeplaatst? Als controle zullen we de resultaten vergelijken van IVF-pogingen waarbij alleen lichtmicroscopische evaluatie wordt uitgevoerd.

Primair eindpunt: bevalling per gerandomiseerde patiënt. Secundaire eindpunten: cumulatief zwangerschapspercentage inclusief latere overdracht van resterende gevitrificeerde blastocysten (hoger percentage verwacht in onderzoeksgroep). Miskraampercentage tijdens de eerste 18 weken van de zwangerschap (lager verwacht in de onderzoeksgroep).

Methoden en materialen Patiënten Echtparen met een voorgeschiedenis van ten minste drie mislukte IVF-pogingen, waarbij de vrouw maximaal 39 jaar oud is, zullen samen met hun consult worden uitgenodigd voor een nieuwe IVF-behandeling in een van de IVF Sweden-klinieken om deel te nemen in de studie, op voorwaarde dat ze voldoen aan de opnamecriteria (inclusief verwachte normale respons op hormoonstimulatie met 8-10 eieren). De vrouwen die ermee instemmen om aan het onderzoek deel te nemen, worden gerandomiseerd (via de computer) naar de biopsiegroep of naar de controlegroep op de dag na het verzamelen van eicellen als ze ten minste 5 bevruchte eicellen hebben (huidige procedure voor kweken op dag 5).

Inclusiecriteria: paren die voldoen aan de criteria voor een IVF-behandeling en die een voorgeschiedenis hebben van ten minste drie eerdere IVF-cycli, inclusief embryotransfer zonder bevalling. De vrouw mag ten tijde van het onderzoek maximaal 39 jaar oud zijn en moet een normaal-goede ovariële reserve hebben (minstens 12 antrale follikels). Haar partner moet een spermamonster met levend sperma kunnen verstrekken. Vrouwen die deelnemen aan de studie zullen niet deelnemen aan enig ander onderzoeksproject.

Uitsluitingscriteria: Myoma of andere baarmoederlaesies waarvan wordt aangenomen dat ze de implantatie beïnvloeden. Niet-specifieke cysten die niet als functioneel worden beschouwd. Endometrium >3 cm.

Randomisatie

Randomisatie vindt plaats op dag 1 als het koppel voldoet aan de gestelde eisen voor kweek tot blastocyststadium (minstens 5 normaal bevruchte eicellen). Het online randomisatieprogramma (geautomatiseerd) zal de volgende parameters balanceren:

• Leeftijd
• Aantal gewonnen eicellen

Bovendien zal het randomisatieprogramma er op het moment van randomisatie rekening mee houden dat er sprake is van een multicenter studie om vertekening te voorkomen.

IVF-behandeling Hormoonstimulatie, echografie, verzameling van eicellen en bevruchting volgen de standaardprocedure. Voor vrouwen in de controlegroep worden alle geëxpandeerde blastocysten dag 5-6 gecryopreserveerd (verglaasd) voor latere overdracht. Voor vrouwen die gerandomiseerd zijn naar PGS, zal op dag 5-6 van cellen (trofectodermcellen in de buitenste cellaag van het embryo) een biopsie worden genomen, waarna alle gebiopteerde blastocysten zullen worden verglaasd. Als de analyse een normale chromosoomset laat zien, wordt de blastocyst ontdooid en overgedragen tijdens de volgende menstruatiecyclus.

Biopsie en cellysis De biopsie wordt uitgevoerd door met behulp van lasertechnologie en speciale biopsieapparatuur een gaatje te maken in de schil van de blastocyst (zona pellucida) en 2-5 cellen uit de buitenste celmassa (trofoblastcellen) te verwijderen. De cellen worden overgebracht naar een reageerbuis met PBS-oplossing. Er wordt een extractieoplossing toegevoegd om de cellen te lyseren en het DNA komt vrij in de oplossing.

Optimalisatie van genoomamplificatie Om het protocol voor cellysis en volledige genoomamplificatie te optimaliseren, zullen zowel cellen van een embryonale stamcellijn met trisomie 13 als van een normaal karyotype gebruikt worden. Drie, vier en vijf cellen worden respectievelijk in PCR-buisjes gepipetteerd. Het volledige aCGH-protocol (zie hieronder) wordt uitgevoerd op deze cellen (minstens 50 buisjes) en de resultaten worden geëvalueerd. Deze aanpak geeft ons een idee van de gevoeligheid van de methode en hoe vaak we er niet in slagen om resultaten te verkrijgen als gevolg van mislukte amplificatie. Eventuele verontreinigingen in het systeem zullen ook worden onthuld.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Reagens voor amplificatie (kopiëren) van het DNA wordt toegevoegd aan het DNA-extract. Amplificatie wordt in verschillende stappen uitgevoerd met behulp van een techniek die "Polymerase Chain Reaction" (PCR) wordt genoemd. Dit proces vereist grote nauwkeurigheid en speciale laboratoriumfaciliteiten, zodat vreemd DNA het monster niet besmet. Besmetting bij deze stap kan leiden tot een verkeerde diagnose van de chromosoomsamenstelling van de embryo's. Het geamplificeerde DNA wordt vervolgens gelabeld met een fluorescerend molecuul dat ervoor zorgt dat het DNA groen fluoresceert onder UV-belichting. Evenzo wordt normaal controle-DNA gelabeld met een molecuul dat rood fluoresceert onder UV-belichting. Geamplificeerd fluorescerend gemerkt DNA wordt gemengd met een gelijk volume normaal fluorescerend gemerkt controle-DNA. Dit DNA-mengsel wordt aangebracht op testoppervlakken met specifieke DNA-sequenties. Deze DNA-sequenties worden zorgvuldig geselecteerd en in lange reeksen in een specifieke volgorde op de testoppervlakken geplaatst, wat betekent dat DNA van alle chromosoomarmen op specifieke locaties op het testoppervlak wordt weergegeven. Tijdens de hybridisatiestap zal het DNA in het DNA-mengsel strijden om binding aan het DNA op het testoppervlak. Als er gelijke hoeveelheden geamplificeerd DNA (groen) en controle-DNA (rood) zijn, dan zal een gelijke hoeveelheid DNA van beide fracties aan het testoppervlak binden. Na hybridisatie, wanneer het testoppervlak wordt verlicht met UV-licht, zullen de groene en rode fluorescentie even intens zijn, wat resulteert in een oranje kleur (mengsel met gelijke delen rode en groene kleur). Als er echter een teveel aan DNA van een bepaald chromosoom in het embryo is (bijv. trisomie), zullen meer DNA-sequenties van dit chromosoom zich aan het testoppervlak binden, wat resulteert in een teveel aan groene fluorescentie in het gebied op het testoppervlak dat de DNA-sequenties van het betreffende chromosoom. Evenzo resulteert verlies van een chromosoom in een embryo in een tekort aan het overeenkomstige DNA in de geamplificeerde fractie, waardoor meer controle-DNA-sequenties (rood) aan het testoppervlak binden. Testgebieden worden gescand en de resultaten worden automatisch verwerkt in een computergestuurde scanner.

Beoordeling van embryo's:

Evaluatie en classificatie van de blastocysten zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de geaccepteerde classificatie volgens Gardner, waarbij mate van expansie, celdichtheid en aantal cellen in de binnenste celmassa (IC) en in het trophectoderm (TE) worden beoordeeld. Alle blastocysten in de controlegroep worden verglaasd voor latere overdracht. Een soortgelijke evaluatie zal worden uitgevoerd in de biopsiegroep voorafgaand aan de biopsie. Na de biopsie worden alle gebiopteerde blastocysten verglaasd.

In de groep waarin de biopsie wordt uitgevoerd, wordt microarray-analyse uitgevoerd. De overdracht gebeurt tijdens de natuurlijke menstruatiecyclus 5 dagen na de ovulatie. Vrouwen met hormonale ontregeling hebben milde hormonale stimulatie nodig voorafgaand aan de overdracht van de verglaasde/verwarmde blastocyst.

Vitrificatie Nadat de biopsie van de blastocysten is uitgevoerd, worden ze verglaasd en vervolgens ontdooid volgens het gevestigde protocol in de klinieken.

Follow-up Het primaire eindpunt is geboorte per gerandomiseerde patiënt. Secundaire eindpunten zijn het cumulatieve zwangerschapspercentage, aangezien extra gecryopreserveerde blastocysten (indien aanwezig) ook worden overgedragen, en het aantal miskramen tijdens de eerste 18 weken van de zwangerschap (lager percentage verwacht in de onderzoeksgroep). We zijn van plan om een ​​Data Safety Monitoring Board (DSMB) op te richten, bestaande uit onafhankelijke externe experts wanneer de helft van het onderzoek is afgerond.

De opvolging van alle zwangerschappen en bevallingen vindt plaats volgens de huidige procedure binnen IVF.

Statistieken Power-analyse heeft aangetoond dat voor het detecteren van een significant verschil in zwangerschapsuitkomsten van de geschatte 15% in de controlegroep tot 40% in de PGS-groep 112 patiënten nodig zijn (alfa=0,8; Bèta = 0,20). Een geschat uitvalpercentage van ongeveer 10% en de geplande DSMB-analyse betekenen dat 130 patiënten moeten worden aangeworven. De DSMB zal het onderzoek monitoren en periodiek advies geven of we het onderzoek moeten voortzetten. De DSMB-analyse geeft 3 aanbevelingen: (1) zet de studie voort zoals gepland, (2) stop de studie als het verschil tussen de groepen minder dan 15% is, (3) zet de studie voort met een grotere steekproefomvang. Wanneer het verschil tussen de groepen 20% of groter is, kan het onderzoek worden voortgezet met een grotere steekproefomvang (73 patiënten in elke groep). stroom. DSMB kan zowel levendgeborenen als doorgaande zwangerschap evalueren en alle informatie wegen wanneer zij de aanbeveling geven. De DSMB zal bestaan ​​uit specialisten die ervaring hebben op dit gebied. Statistische berekeningen zullen worden uitgevoerd volgens intention-to-treat (ITT), evenals per protocol. ITT zijn allemaal gerandomiseerde patiënten met ten minste 5 bevruchte eicellen op dag 1. Sommige patiënten hebben waarschijnlijk geen overdracht vanwege het ontbreken van blastocysten of technische problemen met betrekking tot vitrificatie/opwarming enz. Daarom zal er ook per protocol geanalyseerd worden. Logistische regressie wordt gebruikt in de statistische berekeningen en omvat de stratificatievariabelen.