PGS utilizando microarrays en pacientes de FIV con fracaso de implantación repetido

Antecedentes La fertilización in vitro (FIV) es el método más importante para remediar la infertilidad, ya sea que la causa sea masculina o femenina, o cuando se desconoce la causa. El tratamiento suele implicar la transferencia al útero de un óvulo fertilizado (embrión) que ha sido cultivado durante 2 a 5 días. Para seleccionar el embrión con la mejor probabilidad de implantación exitosa en el endometrio, actualmente se utiliza la evaluación microscópica para clasificar la división celular embrionaria, la apariencia celular y otros factores. Pero este método es incompleto porque no puede determinar las propiedades funcionales del embrión, o si es genéticamente normal. Se sabe que las parejas con antecedentes de múltiples tratamientos de FIV sin éxito producen una gran cantidad de embriones que tienen una cantidad anormal de cromosomas (aneuploidía), que también es común en mujeres mayores de 38 años.

Este proyecto tiene la intención de utilizar el cribado genético preimplantacional (PGS) con la técnica de microarrays para determinar la composición cromosómica de los óvulos fertilizados, de modo que solo se transfieran embriones cromosómicamente normales durante la FIV. El propósito es aumentar la probabilidad de embarazo y parto entre parejas con antecedentes de repetidos intentos fallidos de FIV. Anteriormente, realizamos un estudio prospectivo aleatorizado con una pregunta similar (Ö 612-02) en un grupo objetivo de mujeres mayores (> 38 años) mediante el muestreo (biopsia) del embrión en el día 3 de cultivo, seguido de análisis de siete cromosomas. parejas utilizando la técnica FISH. Los resultados del estudio no mostraron mejoría en el resultado del embarazo. Las razones son probablemente 1) para empezar, los óvulos normales son poco frecuentes en este grupo objetivo; 2) la biopsia se realizó el día 3 cuando el embrión se encuentra en una etapa sensible; y 3) solo se pudieron analizar 7 de un total de 23 pares de cromosomas.

Los avances metodológicos en el campo han sido rápidos y la tecnología actual permite una mejor identificación de los embriones normales en comparación con el estudio anterior.

• Sabemos que el embrión es menos sensible cuando se realiza una biopsia el día 5 (del estadio de blastocisto) en lugar del día 3.
• En la biopsia de blastocisto, se extraen más células para el diagnóstico que en una biopsia del día 3 (lo que aumenta la fiabilidad del análisis).
• La biopsia de blastocisto implica la eliminación de menos células en porcentaje (3-5 %) de la masa celular total del blastocisto en comparación con la biopsia del día 3 utilizada anteriormente, que implicaba la eliminación de hasta el 25 % del número total de células.
• Los blastocistos tienen una tasa de implantación más alta que los embriones de 3 días.
• La hibridación genómica comparativa en matriz (aCGH) ahora se puede utilizar con gran precisión para analizar todos los cromosomas utilizando kits comerciales con control de calidad.
• La criopreservación con vitrificación de blastocistos es actualmente una técnica de gran éxito que permite realizar el análisis sin presiones de tiempo.

Además, recurriremos a un grupo de pacientes formado por mujeres con reserva ovárica normal-buena comprobada. En el estudio previo que involucró a mujeres >38 años, la reserva ovárica fue generalmente pobre.

El trabajo preparatorio de la Ley de Integridad Genética establecía que el PGS debería "reservarse para proyectos de investigación claramente definidos y aprobados en una revisión ética por parte de un comité de ética". Esta restricción se impuso porque el estado del conocimiento sobre SPG en ese momento era muy limitado. Se consideró necesaria más experiencia de proyectos de investigación sobre PGS para determinar si el PGS podría usarse en la práctica clínica. El trabajo preparatorio antes mencionado para la Ley de Integridad Genética también establece que el PGS "puede convertirse en una herramienta importante para aumentar las posibilidades de embarazo junto con el tratamiento de FIV...". En este proyecto pretendemos investigar si es posible aumentar las posibilidades de embarazo y parto entre parejas que han pasado por varios intentos fallidos de FIV. Nuestra hipótesis se basa en la suposición de que un número incorrecto de cromosomas suele ser la causa subyacente de una implantación fallida o un aborto espontáneo. Para aumentar las posibilidades de establecer un embarazo que conduzca al parto, estamos realizando un análisis de cromosomas en los embriones de las parejas para garantizar que solo se transfieran a la mujer embriones con un juego de cromosomas normal.

Pregunta ¿Puede aumentar la probabilidad de embarazo y parto en parejas con varios intentos previos de FIV fallidos si se puede asegurar un conjunto cromosómico normal en el embrión antes de que se transfiera? Como control, compararemos los resultados de los intentos de FIV en los que solo se realiza una evaluación microscópica de luz.

Criterio de valoración principal: Parto por paciente aleatorizada Criterios de valoración secundarios: Tasa de embarazo acumulada, incluida la transferencia posterior de los blastocistos vitrificados restantes (tasa más alta esperada en el grupo de estudio). Tasa de aborto espontáneo durante las primeras 18 semanas de embarazo (tasa más baja esperada en el grupo de estudio).

Métodos y materiales Pacientes Las parejas con un historial de al menos tres intentos fallidos de FIV, en los que la mujer tiene un máximo de 39 años de edad, serán invitadas a participar junto con su consulta para un nuevo tratamiento de FIV en cualquiera de las clínicas de IVF Suecia. en el estudio, siempre que cumplan los criterios de inclusión (incluida la respuesta normal esperada a la estimulación hormonal con 8-10 óvulos). Las mujeres que acepten participar en el estudio serán aleatorizadas (por computadora) al grupo de biopsia o de control el día después de la recolección de ovocitos si tienen al menos 5 óvulos fertilizados (procedimiento actual para cultivo el día 5).

Criterios de inclusión: Parejas que cumplan con los criterios para el tratamiento de FIV y que tengan antecedentes de al menos tres ciclos de FIV anteriores, incluida la transferencia de embriones sin parto. La mujer puede tener como máximo 39 años cuando se realiza el estudio y debe tener una reserva ovárica normal-buena (al menos 12 folículos antrales). Su pareja debe poder proporcionar una muestra de semen que contenga espermatozoides vivos. Las mujeres incluidas en el estudio no participarán en ningún otro proyecto de investigación.

Criterios de exclusión: mioma u otras lesiones uterinas que se considere que afectan la implantación. Quistes inespecíficos que no se consideran funcionales. Endometrio > 3 cm.

Aleatorización

La aleatorización se realizará el día 1 si la pareja cumple los requisitos establecidos para el cultivo hasta el estadio de blastocisto (al menos 5 ovocitos normalmente fecundados). El programa de aleatorización en línea (computarizado) equilibrará los siguientes parámetros:

• Edad
• Número de ovocitos recuperados

Además, en el momento de la aleatorización, el programa de aleatorización tendrá en cuenta que se trata de un estudio multicéntrico para evitar sesgos.

Tratamiento de FIV La estimulación hormonal, los controles de ultrasonido, la recolección de ovocitos y la fertilización seguirán el procedimiento estándar. Para las mujeres del grupo de control, todos los blastocistos expandidos se crioconservarán (vitrificarán) el día 5 o 6 para su transferencia posterior. Para las mujeres asignadas al azar a PGS, se realizará una biopsia de las células (células de trofoectodermo en la capa celular externa del embrión) el día 5-6, después de lo cual se vitrificarán todos los blastocistos de la biopsia. Si el análisis muestra un juego de cromosomas normal, el blastocisto se descongelará y se transferirá durante el próximo ciclo menstrual.

Biopsia y lisis celular La biopsia se lleva a cabo haciendo un agujero en la cubierta del blastocisto (zona pelúcida) utilizando tecnología láser y un equipo de biopsia especial y extrayendo de 2 a 5 células de la masa celular externa (células trofoblásticas). Las células se transfieren a un tubo de ensayo que contiene solución de PBS. Se agrega una solución de extracción para lisar las células y el ADN se libera en la solución.

Optimización de la amplificación del genoma Para optimizar el protocolo de lisis celular y amplificación del genoma completo, se utilizarán células de una línea de células madre embrionarias con trisomía 13 y de un cariotipo normal. Se pipetearán tres, cuatro y cinco células respectivamente en tubos PCR. Todo el protocolo aCGH (ver más abajo) se ejecutará en estas células (al menos 50 tubos) y se evaluarán los resultados. Este enfoque nos dará una idea de la sensibilidad del método y de la frecuencia con la que no obtenemos resultados debido a una amplificación fallida. La contaminación en el sistema, si la hay, también será revelada.

Hibridación genómica comparativa de matriz (aCGH) El reactivo para la amplificación (copia) del ADN se agrega al extracto de ADN. La amplificación se lleva a cabo en varios pasos usando una técnica llamada "Reacción en Cadena de la Polimerasa" (PCR). Este proceso requiere una gran precisión e instalaciones de laboratorio especiales para que el ADN extraño no contamine la muestra. La contaminación en este paso podría conducir a un diagnóstico erróneo de la constitución cromosómica de los embriones. Luego, el ADN amplificado se marca con una molécula fluorescente que hace que el ADN emita una fluorescencia verde bajo la iluminación ultravioleta. De manera similar, el ADN de control normal se marca con una molécula que emite fluorescencia roja bajo iluminación ultravioleta. El ADN marcado con fluorescencia amplificado se mezcla con un volumen igual de ADN de control marcado con fluorescencia normal. Esta mezcla de ADN se aplica a superficies de prueba con secuencias de ADN específicas. Estas secuencias de ADN se seleccionan cuidadosamente y se colocan en las superficies de prueba en formaciones largas en un orden específico, lo que significa que el ADN de todos los brazos cromosómicos se representa en la superficie de prueba en ubicaciones específicas. Durante el paso de hibridación, el ADN de la mezcla de ADN competirá por unirse al ADN de la superficie de prueba. Si hay cantidades iguales de ADN amplificado (verde) y ADN de control (rojo), entonces una cantidad igual de ADN de ambas fracciones se unirá a la superficie de prueba. Después de la hibridación, cuando la superficie de prueba se ilumina con luz ultravioleta, la fluorescencia verde y roja será igualmente intensa, dando como resultado un color naranja (mezcla con partes iguales de color rojo y verde). Sin embargo, si hay un exceso de ADN de un cromosoma dado en el embrión (p. ej., trisomía), más secuencias de ADN de este cromosoma se unirán a la superficie de prueba, lo que dará como resultado un exceso de fluorescencia verde en el área de la superficie de prueba que contiene las secuencias de ADN del cromosoma correspondiente. De manera similar, la pérdida de un cromosoma en un embrión da como resultado una escasez del ADN correspondiente en la fracción amplificada, lo que hace que más secuencias de ADN de control (en rojo) se unan a la superficie de prueba. Las áreas de prueba se escanean y los resultados se procesan automáticamente en un escáner computarizado.

Clasificación de embriones:

La evaluación y clasificación de los blastocistos se realizará de acuerdo con la clasificación aceptada según Gardner en la que se evalúan el grado de expansión, la densidad celular y el número de células en la masa celular interna (IC) y en el trofectodermo (TE). Todos los blastocistos del grupo control serán vitrificados para su posterior transferencia. Se realizará una evaluación similar en el grupo de biopsia antes de la biopsia. Después de la biopsia, se vitrificarán todos los blastocistos biopsiados.

En el grupo en el que se realiza la biopsia, se realizará un análisis de micromatrices. La transferencia se realiza durante el ciclo menstrual natural 5 días después de la ovulación. Las mujeres con alteraciones hormonales requieren una estimulación hormonal leve antes de la transferencia del blastocisto vitrificado/calentado.

Vitrificación Después de que los blastocistos hayan sido biopsiados, serán vitrificados y posteriormente descongelados de acuerdo con un protocolo bien establecido en las clínicas.

Seguimiento El criterio principal de valoración es el nacimiento por paciente aleatorizado. Los criterios de valoración secundarios son la tasa de embarazo acumulada, ya que también se transfieren blastocistos crioconservados adicionales (si los hay), y la tasa de aborto espontáneo durante las primeras 18 semanas de embarazo (tasa más baja esperada en el grupo de estudio). Planeamos crear una Junta de Monitoreo de Seguridad de Datos (DSMB) compuesta por expertos externos independientes cuando se haya completado la mitad del estudio.

El seguimiento de todos los embarazos y partos se realizará de acuerdo con el procedimiento actual dentro de la FIV.

El análisis de Statistics Power ha demostrado que para detectar una diferencia significativa en los resultados del embarazo del 15 % estimado en el grupo de control al 40 % en el grupo de PGS se requieren 112 pacientes (alfa = 0,8; Beta=0.20). Una tasa de deserción estimada de alrededor del 10% y el análisis DSMB planificado significan que se deben reclutar 130 pacientes. El DSMB supervisará el estudio y brindará asesoramiento periódico sobre si debemos continuar con el estudio. El análisis DSMB dará 3 recomendaciones: (1) continuar el estudio según lo planeado, (2) detener el estudio si la diferencia entre los grupos es inferior al 15 %, (3) continuar el estudio con una muestra más grande. Cuando la diferencia entre los grupos es del 20 % o más, el estudio puede continuar con un tamaño de muestra mayor (73 pacientes en cada grupo). El análisis DSMB aconsejará continuar o detener el estudio (debido al efecto altamente significativo, efecto negativo o condicional bajo fuerza. DSMB puede evaluar tanto a los nacidos vivos como a los embarazos en curso y sopesar toda la información cuando dan la recomendación. El DSMB estará compuesto por especialistas con experiencia en este campo. Los cálculos estadísticos se realizarán por intención de tratar (ITT), así como por protocolo. ITT son todas pacientes aleatorizadas, que tienen al menos 5 ovocitos fertilizados el día 1. Es probable que algunos pacientes no tengan transferencia debido a la falta de blastocistos, o problemas técnicos relacionados con la vitrificación/calentamiento, etc. Por lo tanto, el análisis también se hará por protocolo. La regresión logística se utilizará en los cálculos estadísticos e incluirá las variables de estratificación.