PGS usando Microarray em pacientes de fertilização in vitro com falha de implantação repetida

Antecedentes A fertilização in vitro (FIV) é o método mais importante para remediar a infertilidade, quer a causa seja masculina ou feminina, ou quando a causa é desconhecida. O tratamento geralmente envolve a transferência para o útero de um óvulo fertilizado (embrião) que foi cultivado por 2 a 5 dias. Para selecionar o embrião com a melhor chance de implantação bem-sucedida no endométrio, a avaliação microscópica é atualmente usada para classificar a divisão celular embrionária, a aparência celular e outros fatores. Mas esse método é incompleto porque não pode determinar as propriedades funcionais do embrião ou se é geneticamente normal. Sabe-se que casais com histórico de múltiplas FIV sem sucesso produzem um grande número de embriões com número anormal de cromossomos (aneuploidia), o que também é comum em mulheres com mais de 38 anos.

Este projeto pretende usar a triagem genética pré-implantação (PGS) com a técnica de microarray para determinar a composição cromossômica de óvulos fertilizados, de modo que apenas embriões cromossomicamente normais sejam transferidos durante a fertilização in vitro. O objetivo é aumentar a probabilidade de gravidez e parto entre casais com histórico de repetidas tentativas malsucedidas de fertilização in vitro. Conduzimos anteriormente um estudo prospectivo randomizado com uma pergunta semelhante (Ö 612-02) em um grupo-alvo de mulheres mais velhas (> 38 anos) usando amostragem (biópsia) do embrião no dia 3 de cultura, seguido de análise de sete cromossomos pares usando a técnica FISH. Os resultados do estudo não mostraram melhora no resultado da gravidez. As razões são provavelmente 1) para começar, os ovos normais são pouco frequentes neste grupo-alvo; 2) a biópsia foi realizada no dia 3, quando o embrião está em um estágio sensível; e 3) apenas 7 de um total de 23 pares de cromossomos puderam ser analisados.

Os desenvolvimentos metodológicos no campo foram rápidos e a tecnologia atual permite uma melhor identificação de embriões normais em comparação com o estudo anterior.

• Sabemos que o embrião é menos sensível quando a biópsia é realizada no dia 5 (do estágio de blastocisto) em vez do dia 3.
• Na biópsia de blastocisto, mais células são removidas para diagnóstico do que em uma biópsia de 3 dias (aumentando assim a confiabilidade da análise).
• A biópsia de blastocisto envolve a remoção de menos células em uma porcentagem (3-5%) da massa celular total do blastocisto em comparação com a biópsia do dia 3 usada anteriormente, que envolvia a remoção de até 25% do número total de células.
• Os blastocistos têm uma taxa de implantação mais alta do que os embriões de 3º dia.
• A hibridização genômica comparativa de arranjos (aCGH) agora pode ser usada com grande precisão para analisar todos os cromossomos usando kits comerciais com controle de qualidade.
• A criopreservação com vitrificação de blastocistos é atualmente uma técnica de grande sucesso que permite que a análise seja realizada sem pressão de tempo.

Além disso, nos voltaremos para um grupo de pacientes composto por mulheres com reserva ovariana normal-boa comprovada. No estudo anterior envolvendo mulheres >38 anos, a reserva ovariana era geralmente baixa.

O trabalho preparatório para a Lei de Integridade Genética afirmou que o PGS deveria "ser reservado para projetos de pesquisa claramente definidos e aprovados em uma revisão ética por um comitê de ética". Essa restrição foi imposta porque o estado de conhecimento sobre SPG naquela época era muito limitado. Mais experiência de projetos de pesquisa em PGS foi considerada necessária para determinar se o PGS poderia ser usado na prática clínica. O trabalho preparatório acima mencionado para a Lei de Integridade Genética também afirma que o PGS "pode ​​se tornar uma ferramenta importante para aumentar as chances de gravidez em conjunto com o tratamento de fertilização in vitro ...". Neste projeto, pretendemos investigar se é possível aumentar a chance de gravidez e parto entre casais que passaram por várias tentativas anteriores de FIV fracassadas. Nossa hipótese é baseada na suposição de que um número incorreto de cromossomos é frequentemente a causa subjacente de falha na implantação ou aborto espontâneo. Para aumentar as chances de estabelecer uma gravidez que leve ao parto, estamos realizando uma análise cromossômica nos embriões dos casais para garantir que apenas embriões com um conjunto cromossômico normal sejam transferidos para a mulher.

Questão A probabilidade de gravidez e parto em casais com várias tentativas anteriores de fertilização in vitro fracassadas pode aumentar se um conjunto cromossômico normal puder ser assegurado no embrião antes de ser transferido? Como controle, compararemos os resultados das tentativas de fertilização in vitro, onde apenas a avaliação microscópica é realizada.

Desfecho primário: Parto por paciente randomizado Desfechos secundários: Taxa cumulativa de gravidez, incluindo transferência posterior de blastocistos vitrificados remanescentes (taxa mais alta esperada no grupo de estudo). Taxa de aborto durante as primeiras 18 semanas de gravidez (menor taxa esperada no grupo de estudo).

Métodos e materiais Pacientes Casais com histórico de pelo menos três tentativas infrutíferas de fertilização in vitro, nas quais a mulher tenha no máximo 39 anos de idade, serão convidados em conjunto com sua consulta para um novo tratamento de fertilização in vitro em qualquer uma das clínicas de fertilização in vitro da Suécia para participar no estudo, desde que atendam aos critérios de inclusão (incluindo resposta normal esperada à estimulação hormonal com 8-10 óvulos). As mulheres que concordarem em participar do estudo serão randomizadas (por computador) para a biópsia ou para o grupo controle no dia seguinte à coleta dos oócitos se tiverem pelo menos 5 óvulos fertilizados (procedimento atual para cultura no dia 5).

Critérios de inclusão: Casais que atendem aos critérios para tratamento de fertilização in vitro e que tenham histórico de pelo menos três ciclos anteriores de fertilização in vitro, incluindo transferência de embriões sem parto. A mulher pode ter no máximo 39 anos quando o estudo é realizado e deve ter uma reserva ovariana normal-boa (pelo menos 12 folículos antrais). Seu parceiro deve ser capaz de fornecer uma amostra de sêmen contendo esperma vivo. As mulheres incluídas no estudo não participarão de nenhum outro projeto de pesquisa.

Critérios de exclusão: mioma ou outras lesões uterinas que possam afetar a implantação. Cistos inespecíficos que não são considerados funcionais. Endométrio > 3 cm.

Randomization

A randomização ocorrerá no dia 1 se o casal atender aos requisitos estabelecidos para cultura até o estágio de blastocisto (pelo menos 5 ovócitos normalmente fertilizados). O programa de randomização on-line (computadorizado) balanceará os seguintes parâmetros:

• Idade
• Número de oócitos recuperados

Além disso, no momento da randomização, o programa de randomização levará em conta que um estudo multicêntrico está envolvido para evitar viés.

Tratamento de fertilização in vitro A estimulação hormonal, as verificações de ultrassom, a coleta de oócitos e a fertilização seguirão o procedimento padrão. Para mulheres no grupo de controle, todos os blastocistos expandidos serão criopreservados (vitrificados) dia 5-6 para transferência posterior. Para as mulheres randomizadas para PGS, as células (células do trofectoderma na camada celular externa do embrião) serão biopsiadas no dia 5-6, após o que todos os blastocistos biopsiados serão vitrificados. Se a análise mostrar um conjunto cromossômico normal, o blastocisto será descongelado e transferido durante o próximo ciclo menstrual.

Biópsia e lise celular A biópsia é realizada fazendo um orifício na casca do blastocisto (zona pelúcida) usando tecnologia laser e equipamento de biópsia especial e removendo 2-5 células da massa celular externa (células trofoblásticas). As células são transferidas para um tubo de ensaio contendo solução de PBS. Uma solução de extração é adicionada para lisar as células e o DNA é liberado na solução.

Otimização da amplificação do genoma Para otimizar o protocolo de lise celular e amplificação do genoma completo, serão utilizadas células de uma linhagem de células-tronco embrionárias com trissomia 13, bem como de um cariótipo normal. Três, quatro e cinco células, respectivamente, serão pipetadas em tubos de PCR. Todo o protocolo aCGH (veja abaixo) será executado nessas células (pelo menos 50 tubos) e os resultados serão avaliados. Essa abordagem nos dará uma ideia da sensibilidade do método e quantas vezes não conseguimos obter resultados devido à amplificação malsucedida. A contaminação no sistema, se houver, também será revelada.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) O reagente para amplificação (cópia) do DNA é adicionado ao extrato de DNA. A amplificação é realizada em várias etapas usando uma técnica chamada "Reação em Cadeia da Polimerase" (PCR). Este processo requer grande precisão e instalações laboratoriais especiais para que o DNA estranho não contamine a amostra. A contaminação nesta etapa pode levar a um diagnóstico incorreto da constituição cromossômica dos embriões. O DNA amplificado é então marcado com uma molécula fluorescente que faz com que o DNA fique verde fluorescente sob iluminação ultravioleta. Da mesma forma, o DNA de controle normal é marcado com uma molécula que fica fluorescente em vermelho sob iluminação ultravioleta. O ADN amplificado marcado com fluorescência é misturado com um volume igual de ADN de controlo normal marcado com fluorescência. Essa mistura de DNA é aplicada em superfícies de teste com sequências específicas de DNA. Essas sequências de DNA são cuidadosamente selecionadas e colocadas nas superfícies de teste em longas matrizes em uma ordem específica, o que significa que o DNA de todos os braços do cromossomo é representado na superfície de teste em locais específicos. Durante a etapa de hibridação, o DNA na mistura de DNA competirá pela ligação ao DNA na superfície do teste. Se houver quantidades iguais de DNA amplificado (verde) e DNA de controle (vermelho), uma quantidade igual de DNA de ambas as frações se ligará à superfície de teste. Após a hibridação, quando a superfície de teste é iluminada com luz ultravioleta, a fluorescência verde e vermelha será igualmente intensa, resultando em uma cor laranja (mistura com porções iguais de vermelho e verde). No entanto, se houver um excesso de DNA de um determinado cromossomo no embrião (por exemplo, trissomia), mais sequências de DNA desse cromossomo se ligarão à superfície de teste, resultando em um excesso de fluorescência verde na área da superfície de teste contendo as sequências de DNA do cromossomo relevante. Da mesma forma, a perda de um cromossomo em um embrião resulta na falta do DNA correspondente na fração amplificada, fazendo com que mais sequências de DNA de controle (vermelhas) se liguem à superfície do teste. As áreas de teste são digitalizadas e os resultados processados ​​automaticamente em um scanner computadorizado.

Classificação de embriões:

A avaliação e classificação dos blastocistos serão feitas de acordo com a classificação aceita de acordo com Gardner, na qual são avaliados o grau de expansão, a densidade celular e o número de células na massa celular interna (IC) e no trofectoderma (TE). Todos os blastocistos do grupo controle serão vitrificados para posterior transferência. Uma avaliação semelhante será realizada no grupo de biópsia antes da biópsia. Após a biópsia, todos os blastocistos biopsiados serão vitrificados.

No grupo em que a biópsia for realizada, será realizada a análise de microarray. A transferência é feita durante o ciclo menstrual natural, 5 dias após a ovulação. Mulheres com disrupção hormonal requerem estimulação hormonal leve antes da transferência do blastocisto vitrificado/aquecido.

Vitrificação Após a biópsia dos blastocistos, eles serão vitrificados e posteriormente descongelados de acordo com o protocolo bem estabelecido nas clínicas.

Acompanhamento O endpoint primário é o nascimento por paciente randomizado. Os desfechos secundários são a taxa de gravidez cumulativa, uma vez que blastocistos criopreservados extras (se houver) também são transferidos e a taxa de aborto durante as primeiras 18 semanas de gravidez (taxa mais baixa esperada no grupo de estudo). Planejamos criar um Conselho de Monitoramento de Segurança de Dados (DSMB) composto por especialistas externos independentes quando metade do estudo estiver concluído.

O acompanhamento de todas as gestações e partos será realizado de acordo com o procedimento atual da fertilização in vitro.

A análise do Poder Estatístico mostrou que para detectar uma diferença significativa nos resultados da gravidez dos 15% estimados no grupo de controle para 40% no grupo PGS são necessários 112 pacientes (alfa=0,8; Beta=0,20). Uma taxa de atrito estimada de cerca de 10% e a análise DSMB planejada significam que 130 pacientes devem ser recrutados. O DSMB monitorará o estudo e fornecerá conselhos periódicos sobre se devemos continuar o estudo. A análise DSMB dará 3 recomendações: (1) continuar o estudo conforme planejado, (2) interromper o estudo se a diferença entre os grupos for inferior a 15%, (3) continuar o estudo com um tamanho de amostra maior. Quando a diferença entre os grupos for de 20% ou mais, o estudo pode continuar com um tamanho de amostra maior (73 pacientes em cada grupo A análise DSMB aconselhará a continuar ou interromper o estudo (devido a efeito altamente significativo, efeito negativo ou baixo condicional poder. O DSMB pode avaliar tanto o nascido vivo quanto a gravidez em andamento e pesar todas as informações ao dar a recomendação. O DSMB será composto por especialistas com experiência neste campo. Os cálculos estatísticos serão realizados de acordo com a intenção de tratar (ITT), bem como por protocolo. ITT são todos pacientes randomizados, com pelo menos 5 oócitos fertilizados no dia 1. Alguns pacientes provavelmente não terão transferência devido à falta de blastocistos ou problemas técnicos relacionados à vitrificação/aquecimento, etc. Portanto, a análise também será feita por protocolo. A regressão logística será utilizada nos cálculos estatísticos e incluirá as variáveis ​​de estratificação.