PGS utilisant un microréseau chez des patients FIV présentant des échecs d'implantation répétés

Contexte La fécondation in vitro (FIV) est la méthode la plus importante pour remédier à l'infertilité, que la cause soit masculine ou féminine, ou lorsque la cause est inconnue. Le traitement implique généralement le transfert dans l'utérus d'un ovule fécondé (embryon) qui a été cultivé pendant 2 à 5 jours. Pour sélectionner l'embryon avec les meilleures chances d'implantation réussie dans l'endomètre, l'évaluation microscopique est actuellement utilisée pour évaluer la division cellulaire embryonnaire, l'apparence cellulaire et d'autres facteurs. Mais cette méthode est incomplète car elle ne permet pas de déterminer les propriétés fonctionnelles de l'embryon, ni s'il est génétiquement normal. On sait que les couples ayant des antécédents de multiples traitements de FIV infructueux produisent un grand nombre d'embryons qui ont un nombre anormal de chromosomes (aneuploïdie), ce qui est également fréquent chez les femmes de plus de 38 ans.

Ce projet vise à utiliser le dépistage génétique préimplantatoire (PGS) avec la technique des microréseaux pour déterminer la composition chromosomique des ovules fécondés, de sorte que seuls les embryons chromosomiquement normaux soient transférés pendant la FIV. L'objectif est d'augmenter la probabilité de grossesse et d'accouchement chez les couples ayant des antécédents de tentatives répétées de FIV infructueuses. Nous avons précédemment mené une étude prospective randomisée avec une question similaire (Ö 612-02) sur un groupe cible de femmes âgées (> 38 ans) en utilisant un prélèvement (biopsie) de l'embryon au jour 3 de la culture, suivi d'une analyse de sept chromosomes paires en utilisant la technique FISH. Les résultats de l'étude n'ont montré aucune amélioration de l'issue de la grossesse. Les raisons sont probablement 1) pour commencer, les œufs normaux sont peu fréquents dans ce groupe cible ; 2) la biopsie a été réalisée au jour 3 lorsque l'embryon est à un stade sensible ; et 3) seulement 7 paires de chromosomes sur un total de 23 ont pu être analysées.

Les développements méthodologiques dans le domaine ont été rapides et la technologie actuelle permet une meilleure identification des embryons normaux par rapport à l'étude précédente.

• On sait que l'embryon est moins sensible lorsqu'une biopsie est réalisée au jour 5 (du stade blastocyste) au lieu du jour 3.
• Dans la biopsie de blastocyste, plus de cellules sont prélevées pour le diagnostic que lors d'une biopsie au jour 3 (augmentant ainsi la fiabilité de l'analyse).
• La biopsie du blastocyste implique l'élimination de moins de cellules en pourcentage (3 à 5 %) de la masse cellulaire totale du blastocyste par rapport à la biopsie du jour 3 précédemment utilisée, qui impliquait l'élimination de jusqu'à 25 % du nombre total de cellules.
• Les blastocystes ont un taux d'implantation plus élevé que les embryons au jour 3.
• L'hybridation génomique comparative sur réseau (aCGH) peut désormais être utilisée avec une grande précision pour analyser tous les chromosomes à l'aide de kits commerciaux de qualité contrôlée.
• La cryoconservation avec vitrification des blastocystes est actuellement une technique très performante qui permet de réaliser l'analyse sans être pressé par le temps.

De plus, nous nous tournerons vers un groupe de patientes composé de femmes ayant une réserve ovarienne normale-bonne prouvée. Dans l'étude précédente portant sur des femmes de plus de 38 ans, la réserve ovarienne était généralement faible.

Les travaux préparatoires à la loi sur l'intégrité génétique stipulaient que le SPG devait « être réservé à des projets de recherche clairement définis et approuvés dans le cadre d'un examen éthique par un comité d'éthique ». Cette restriction a été imposée parce que l'état des connaissances sur le PGS à cette époque était très limité. Une plus grande expérience des projets de recherche sur le PGS a été jugée nécessaire pour déterminer si le PGS pouvait être utilisé dans la pratique clinique. Les travaux préparatoires mentionnés ci-dessus pour la loi sur l'intégrité génétique indiquent également que le PGS "peut devenir un outil important pour augmenter les chances de grossesse en conjonction avec un traitement de FIV ...". Dans ce projet, nous avons l'intention d'étudier s'il est possible d'augmenter les chances de grossesse et d'accouchement chez les couples qui ont déjà subi plusieurs tentatives de FIV infructueuses. Notre hypothèse est basée sur l'hypothèse qu'un nombre incorrect de chromosomes est souvent la cause sous-jacente d'un échec d'implantation ou d'une fausse couche. Pour augmenter les chances d'établir une grossesse aboutissant à un accouchement, nous effectuons une analyse chromosomique sur les embryons des couples afin de nous assurer que seuls les embryons avec un ensemble de chromosomes normaux sont transférés à la femme.

Question La probabilité de grossesse et d'accouchement chez les couples ayant déjà échoué à plusieurs tentatives de FIV peut-elle augmenter si un jeu de chromosomes normal peut être assuré dans l'embryon avant qu'il ne soit transféré ? À titre de contrôle, nous comparerons les résultats des tentatives de FIV où seule une évaluation au microscope optique est effectuée.

Critère d'évaluation principal : accouchement par patiente randomisée Critères d'évaluation secondaires : taux de grossesse cumulé, y compris le transfert ultérieur des blastocystes vitrifiés restants (taux plus élevé attendu dans le groupe d'étude). Taux de fausses couches au cours des 18 premières semaines de grossesse (taux inférieur attendu dans le groupe d'étude).

Méthodes et matériel Patients Les couples ayant des antécédents d'au moins trois tentatives de FIV infructueuses, dans lesquelles la femme est âgée de 39 ans au maximum, seront invités conjointement avec leur consultation pour un nouveau traitement de FIV dans l'une des cliniques de FIV Suède à participer dans l'étude, à condition qu'ils répondent aux critères d'inclusion (y compris la réponse normale attendue à la stimulation hormonale avec 8 à 10 ovules). Les femmes qui acceptent de participer à l'étude seront randomisées (par ordinateur) soit dans le groupe biopsie, soit dans le groupe témoin le lendemain du prélèvement des ovocytes si elles ont au moins 5 ovules fécondés (procédure actuelle pour la culture au jour 5).

Critères d'inclusion : couples qui répondent aux critères d'un traitement de FIV et qui ont des antécédents d'au moins trois cycles de FIV précédents, y compris le transfert d'embryon sans accouchement. La femme peut être âgée de 39 ans maximum au moment de la réalisation de l'étude et doit avoir une réserve ovarienne normale-bonne (au moins 12 follicules antraux). Son partenaire doit être en mesure de fournir un échantillon de sperme contenant du sperme vivant. Les femmes incluses dans l'étude ne participeront à aucun autre projet de recherche.

Critères d'exclusion : Myome ou autres lésions utérines jugées affecter l'implantation. Kystes non spécifiques qui ne sont pas considérés comme fonctionnels. Endomètre > 3 cm.

Randomisation

La randomisation aura lieu le jour 1 si le couple répond aux exigences établies pour la culture au stade blastocyste (au moins 5 ovocytes normalement fécondés). Le programme de randomisation en ligne (informatisé) équilibrera les paramètres suivants :

• Âge
• Nombre d'ovocytes récupérés

De plus, au moment de la randomisation, le programme de randomisation tiendra compte du fait qu'une étude multicentrique est impliquée pour éviter les biais.

Traitement FIV La stimulation hormonale, les contrôles échographiques, la collecte des ovocytes et la fécondation suivront la procédure standard. Pour les femmes du groupe témoin, tous les blastocystes expansés seront cryoconservés (vitrifiés) le jour 5-6 pour un transfert ultérieur. Pour les femmes randomisées pour le PGS, les cellules (cellules trophectodermiques dans la couche cellulaire externe de l'embryon) seront biopsiées au jour 5-6, après quoi tous les blastocystes biopsiés seront vitrifiés. Si l'analyse montre un ensemble de chromosomes normaux, le blastocyste sera décongelé et transféré au cours du prochain cycle menstruel.

Biopsie et lyse cellulaire La biopsie est réalisée en faisant un trou dans la coquille du blastocyste (zone pellucide) à l'aide de la technologie laser et d'un équipement de biopsie spécial et en retirant 2 à 5 cellules de la masse cellulaire externe (cellules trophoblastes). Les cellules sont transférées dans un tube à essai contenant une solution de PBS. Une solution d'extraction est ajoutée pour lyser les cellules et l'ADN est libéré dans la solution.

Optimisation de l'amplification du génome Pour optimiser le protocole de lyse cellulaire et d'amplification du génome entier, des cellules issues d'une lignée de cellules souches embryonnaires atteintes de trisomie 13 ainsi que d'un caryotype normal seront utilisées. Trois, quatre et cinq cellules seront respectivement pipetées dans des tubes PCR. L'ensemble du protocole aCGH (voir ci-dessous) sera exécuté sur ces cellules (au moins 50 tubes) et les résultats seront évalués. Cette approche nous donnera une idée de la sensibilité de la méthode et de la fréquence à laquelle nous ne parvenons pas à obtenir des résultats en raison d'une amplification infructueuse. La contamination dans le système, le cas échéant, sera également révélée.

Le réactif Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) pour l'amplification (copie) de l'ADN est ajouté à l'extrait d'ADN. L'amplification est réalisée en plusieurs étapes à l'aide d'une technique appelée « Polymerase Chain Reaction » (PCR). Ce processus nécessite une grande précision et des installations de laboratoire spéciales afin que l'ADN étranger ne contamine pas l'échantillon. La contamination à cette étape pourrait conduire à un diagnostic erroné de la constitution chromosomique des embryons. L'ADN amplifié est ensuite marqué avec une molécule fluorescente qui provoque la fluorescence verte de l'ADN sous illumination UV. De même, l'ADN témoin normal est marqué avec une molécule qui émet une fluorescence rouge sous illumination UV. L'ADN marqué par fluorescence amplifié est mélangé avec un volume égal d'ADN témoin normal marqué par fluorescence. Ce mélange d'ADN est appliqué sur des surfaces de test avec des séquences d'ADN spécifiques. Ces séquences d'ADN sont soigneusement sélectionnées et placées sur les surfaces de test dans de longs tableaux dans un ordre spécifique, ce qui signifie que l'ADN de tous les bras chromosomiques est représenté sur la surface de test à des endroits spécifiques. Au cours de l'étape d'hybridation, l'ADN dans le mélange d'ADN entrera en compétition pour se lier à l'ADN sur la surface de test. S'il y a des quantités égales d'ADN amplifié (vert) et d'ADN de contrôle (rouge), alors une quantité égale d'ADN des deux fractions se liera à la surface de test. Après l'hybridation, lorsque la surface d'essai est éclairée par la lumière UV, la fluorescence verte et rouge sera également intense, ce qui se traduira par une couleur orange (mélange avec des portions égales de couleur rouge et verte). Cependant, s'il y a un excès d'ADN d'un chromosome donné dans l'embryon (p. les séquences d'ADN du chromosome concerné. De même, la perte d'un chromosome dans un embryon entraîne une pénurie de l'ADN correspondant dans la fraction amplifiée, provoquant la liaison d'un plus grand nombre de séquences d'ADN de contrôle (rouge) à la surface de test. Les zones de test sont scannées et les résultats sont traités automatiquement dans un scanner informatisé.

Classement des embryons :

L'évaluation et le classement des blastocystes seront effectués conformément à la classification acceptée selon Gardner dans laquelle le degré d'expansion, la densité cellulaire et le nombre de cellules dans la masse cellulaire interne (IC) et dans le trophectoderme (TE) sont évalués. Tous les blastocystes du groupe témoin seront vitrifiés pour un transfert ultérieur. Une évaluation similaire sera effectuée dans le groupe de biopsie avant la biopsie. Après la biopsie, tous les blastocystes biopsiés seront vitrifiés.

Dans le groupe dans lequel la biopsie est effectuée, une analyse par microréseau sera effectuée. Le transfert se fait pendant le cycle menstruel naturel 5 jours après l'ovulation. Les femmes présentant une perturbation hormonale ont besoin d'une légère stimulation hormonale avant le transfert du blastocyste vitrifié/réchauffé.

Vitrification Une fois les blastocystes biopsiés, ils seront vitrifiés puis décongelés selon un protocole bien établi dans les cliniques.

Suivi Le critère de jugement principal est la naissance par patient randomisé. Les critères d'évaluation secondaires sont le taux de grossesse cumulé, puisque des blastocystes supplémentaires cryoconservés (le cas échéant) sont également transférés, et le taux de fausse couche au cours des 18 premières semaines de grossesse (taux inférieur attendu dans le groupe d'étude). Nous prévoyons de créer un Data Safety Monitoring Board (DSMB) composé d'experts externes indépendants lorsque la moitié de l'étude aura été réalisée.

Le suivi de toutes les grossesses et accouchements sera effectué selon la procédure en vigueur au sein de la FIV.

L'analyse Statistics Power a montré que pour détecter une différence significative dans les résultats de la grossesse entre les 15 % estimés dans le groupe témoin et 40 % dans le groupe PGS, il faut 112 patientes (alpha = 0,8 ; Bêta=0,20). Un taux d'attrition estimé à environ 10% et l'analyse prévue du DSMB signifient que 130 patients devraient être recrutés. Le DSMB surveillera l'étude et fournira des conseils périodiques sur l'opportunité de poursuivre l'étude. L'analyse du DSMB donnera 3 recommandations : (1) poursuivre l'étude comme prévu, (2) arrêter l'étude si la différence entre les groupes est inférieure à 15 %, (3) poursuivre l'étude avec un échantillon plus important. Lorsque la différence entre les groupes est de 20 % ou plus, l'étude peut être poursuivie avec un échantillon plus important (73 patients dans chaque groupe). L'analyse du DSMB conseillera de poursuivre ou d'arrêter l'étude (en raison d'un effet hautement significatif, d'un effet négatif ou d'un faible niveau conditionnel). pouvoir. Le DSMB peut évaluer à la fois la naissance vivante et la grossesse en cours et peser toutes les informations lorsqu'il donne la recommandation. Le DSMB sera composé de spécialistes expérimentés dans ce domaine. Les calculs statistiques seront effectués en intention de traiter (ITT), ainsi que par protocole. ITT sont tous des patients randomisés, ayant au moins 5 ovocytes fécondés au jour 1. Certains patients sont susceptibles de ne pas avoir de transfert en raison de l'absence de blastocystes ou de problèmes techniques liés à la vitrification/au réchauffement, etc. Par conséquent, l'analyse sera également effectuée par protocole. La régression logistique sera utilisée dans les calculs statistiques et inclura les variables de stratification.