PGS 在反复植入失败的 IVF 患者中使用微阵列

背景 体外受精 (IVF) 是治疗不孕不育的最重要方法，无论是男性还是女性，还是不明原因。 治疗通常涉及将已培养 2-5 天的受精卵（胚胎）移植到子宫。 为了选择最有可能成功植入子宫内膜的胚胎，目前使用显微镜评估对胚胎细胞分裂、细胞外观和其他因素进行分级。 但这种方法是不完整的，因为它不能确定胚胎的功能特性，或者它是否在遗传上是正常的。 众所周知，有多次 IVF 治疗不成功史的夫妇会产生大量染色体数量异常（非整倍体）的胚胎，这在 38 岁以上的女性中也很常见。

本项目拟通过植入前遗传筛查（PGS）和微阵列技术确定受精卵的染色体组成，从而在体外受精过程中只移植染色体正常的胚胎。 目的是增加有多次 IVF 尝试失败史的夫妇怀孕和分娩的可能性。 我们之前曾在培养第 3 天使用胚胎取样（活检）对目标老年女性（>38 岁）进行了类似问题 (Ö 612-02) 的前瞻性随机研究，然后分析了 7 条染色体使用 FISH 技术配对。 研究结果显示妊娠结局没有改善。 原因可能是 1) 首先，正常鸡蛋在这个目标群体中并不常见； 2)活检于胚胎敏感期第3天进行； 3) 总共 23 对染色体中只有 7 对可以分析。

该领域的方法学发展迅速，与之前的研究相比，目前的技术可以更好地识别正常胚胎。

• 我们知道，在第 5 天（囊胚期）而不是第 3 天进行活检时，胚胎的敏感性较低。
• 在囊胚活检中，与第 3 天活检相比，更多的细胞被移除用于诊断（从而提高了分析的可靠性）。
• 与先前使用的第 3 天活检相比，囊胚活检涉及从囊胚总细胞团中按百分比 (3-5%) 去除较少的细胞，后者涉及去除多达 25% 的细胞总数。
• 囊胚比第 3 天的胚胎具有更高的着床率。
• 阵列比较基因组杂交 (aCGH) 现在可以非常精确地用于使用商业质量控制试剂盒分析所有染色体。
• 囊胚玻璃化冷冻保存是目前非常成功的技术，可以在不紧迫时间的情况下进行分析。

此外，我们将求助于一个患者组，该患者组由经证实具有正常良好卵巢储备的女性组成。 在之前涉及 38 岁以上女性的研究中，卵巢储备普遍较差。

遗传完整性法案的准备工作指出，PGS 应该“保留给伦理委员会在伦理审查中批准的明确定义的研究项目”。 之所以施加这种限制，是因为当时对 PGS 的了解非常有限。 PGS 研究项目的更多经验被认为是确定 PGS 是否可用于临床实践所必需的。 上述遗传完整性法案的准备工作还指出，PGS“可能成为增加怀孕机会的重要工具，与 IVF 治疗相结合……”。 在这个项目中，我们打算调查是否有可能增加曾多次尝试试管婴儿失败的夫妇怀孕和分娩的机会。 我们的假设基于这样的假设，即不正确的染色体数量通常是植入失败或流产的根本原因。 为了增加怀孕并导致分娩的机会，我们正在对夫妇的胚胎进行染色体分析，以确保只将具有正常染色体组的胚胎移植给女性。

Question 如果在移植前能保证胚胎染色体组正常，是否可以增加多次试管婴儿失败的夫妇怀孕和分娩的可能性？ 作为对照，我们将比较仅进行光学显微镜评估的 IVF 尝试的结果。

主要终点：每位随机患者的分娩次要终点：累积妊娠率，包括剩余玻璃化囊胚的后期转移（研究组预期的妊娠率更高）。 妊娠前 18 周内的流产率（研究组的预期流产率较低）。

方法和材料 患者 至少有 3 次 IVF 尝试失败史的夫妇，其中女性最大年龄为 39 岁，将被邀请与他们在瑞典任何 IVF 诊所咨询新的 IVF 治疗一起参加在研究中，前提是他们符合纳入标准（包括对 8-10 个鸡蛋的激素刺激的预期正常反应）。 同意参与研究的女性如果至少有 5 个受精卵（目前的第 5 天培养程序），将在收集卵母细胞后的第二天随机（通过计算机）分配到活检组或对照组。

纳入标准：符合 IVF 治疗标准并且有至少三个 IVF 周期史的夫妇，包括未分娩的胚胎移植。 进行研究时，该女性可能最大为 39 岁，并且必须具有正常良好的卵巢储备（至少 12 个窦状卵泡）。 她的伴侣必须能够提供含有活精子的精液样本。 参与研究的女性将不会参与任何其他研究项目。

排除标准：肌瘤或其他判断影响着床的子宫病变。 被认为没有功能的非特异性包囊。 子宫内膜 >3 厘米。

随机化

如果这对夫妇满足囊胚期培养的要求（至少 5 个正常受精的卵母细胞），将在第 1 天进行随机分组。 在线随机化程序（计算机化）将平衡以下参数：

• 年龄
• 回收的卵母细胞数量

此外，在随机化时，随机化程序将考虑涉及多中心研究以避免偏倚。

IVF 治疗 激素刺激、超声检查、卵母细胞收集和受精将遵循标准程序。 对于对照组中的女性，所有膨胀的囊胚将在第 5-6 天冷冻保存（玻璃化）以供以后移植。 对于随机接受 PGS 的女性，将在第 5-6 天对细胞（胚胎外细胞层中的滋养外胚层细胞）进行活检，之后所有活检囊胚将被玻璃化。 如果分析显示染色体组正常，囊胚将在下一个月经周期解冻并移植。

活检和细胞裂解 活检是通过使用激光技术和特殊活检设备在囊胚（透明带）的壳上打孔并从外部细胞团（滋养层细胞）中取出 2-5 个细胞来进行的。 将细胞转移到含有 PBS 溶液的试管中。 添加提取溶液以裂解细胞，然后将 DNA 释放到溶液中。

基因组扩增的优化 为了优化细胞裂解和全基因组扩增的方案，将使用来自具有 13 三体性的胚胎干细胞系以及来自正常核型的细胞。 分别将三个、四个和五个细胞移液到 PCR 管中。 整个 aCGH 协议（见下文）将在这些细胞（至少 50 个管）上运行，并将评估结果。 这种方法将使我们了解该方法的敏感性以及由于扩增不成功而无法获得结果的频率。 系统中的污染（如果有的话）也将被揭示出来。

阵列比较基因组杂交 (aCGH) 将用于扩增（复制）DNA 的试剂添加到 DNA 提取物中。 使用称为“聚合酶链式反应”(PCR) 的技术分几个步骤进行扩增。 这个过程需要很高的准确性和特殊的实验室设施，这样外来 DNA 就不会污染样本。 此步骤的污染可能导致对胚胎染色体构成的误诊。 然后用荧光分子标记扩增的 DNA，使 DNA 在紫外线照射下发出绿色荧光。 类似地，正常对照 DNA 标记有在紫外线照射下发出红色荧光的分子。 扩增的荧光标记 DNA 与等体积的正常荧光标记对照 DNA 混合。 这种 DNA 混合物用于测试具有特定 DNA 序列的表面。 这些 DNA 序列经过精心挑选，并以特定顺序以长阵列形式放置在测试表面上，这意味着来自所有染色体臂的 DNA 都在特定位置的测试表面上呈现。 在杂交步骤中，DNA 混合物中的 DNA 将竞争结合测试表面上的 DNA。 如果有等量的扩增 DNA（绿色）和对照 DNA（红色），则两个组分中等量的 DNA 将结合到测试表面。 杂交后，当用紫外光照射测试表面时，绿色和红色荧光将同样强烈，产生橙色（红色和绿色等量混合）。 然而，如果胚胎中给定染色体的 DNA 过多（例如三体性），则来自该染色体的更多 DNA 序列将与测试表面结合，导致测试表面上含有过量绿色荧光的区域来自相关染色体的 DNA 序列。 同样，胚胎中染色体的丢失会导致扩增部分中相应 DNA 的短缺，从而导致更多的控制 DNA 序列（红色）与测试表面结合。 扫描测试区域并在计算机扫描仪中自动处理结果。

胚胎分级：

囊胚的评估和分级将根据 Gardner 的公认分类进行，其中评估扩张程度、细胞密度和内细胞团 (IC) 和滋养外胚层 (TE) 中的细胞数量。 对照组中的所有胚泡将被玻璃化以备后用。 在活检之前，将在活检组中进行类似的评估。 活检后，所有活检胚泡都将被玻璃化。

在进行活组织检查的组中，将进行微阵列分析。 转移是在排卵后 5 天的自然月经周期内完成的。 荷尔蒙紊乱的女性在转移玻璃化/加热囊胚之前需要温和的荷尔蒙刺激。

玻璃化 在囊胚被活检后，它们将被玻璃化，然后根据诊所制定的规程解冻。

随访 主要终点是每个随机分配的患者的出生率。 次要终点是累积妊娠率，因为额外的冷冻保存囊胚（如果有的话）也被转移，以及妊娠前 18 周的流产率（研究组的预期流产率较低）。 我们计划在研究完成一半后创建一个由独立外部专家组成的数据安全监控委员会 (DSMB)。

所有怀孕和分娩的跟进将根据 IVF 的现行程序进行。

统计功效分析表明，要检测妊娠结局的显着差异，从对照组估计的 15% 到 PGS 组的 40%，需要 112 名患者（alpha = 0.8； β=0.20）。 估计约 10% 的流失率和计划的 DSMB 分析意味着应招募 130 名患者。 DSMB 将监督研究并定期就我们是否应该继续研究提供建议。 DSMB 分析将给出 3 条建议：(1) 按计划继续研究，(2) 如果组间差异小于 15%，则停止研究，(3) 以更大的样本量继续研究。 当组间差异为 20% 或更大时，可以继续进行更大样本量的研究（每组 73 名患者） DSMB 分析将建议继续或停止研究（由于高度显着的影响、负面影响或低条件力量。 DSMB 可以评估活产和持续妊娠，并在给出建议时权衡所有信息。 DSMB 将由在该领域经验丰富的专家组成。 将根据意向治疗 (ITT) 以及方案进行统计计算。 ITT 都是随机分配的患者，在第 1 天至少有 5 个受精卵。 由于缺乏胚泡，或与玻璃化/加热等相关的技术问题，一些患者可能无法移植。 因此，分析也将按照协议进行。 逻辑回归将用于统计计算并包括分层变量。