PGS använder mikroarray hos IVF-patienter med upprepade implantationsfel

Bakgrund In vitro fertilisering (IVF) är den viktigaste metoden för att åtgärda infertilitet, oavsett om orsaken är den manliga eller honan, eller när orsaken är okänd. Behandlingen innebär vanligtvis överföring till livmodern av ett befruktat ägg (embryo) som har odlats i 2-5 dagar. För att välja embryot med störst chans till framgångsrik implantation i endometriet, används mikroskopisk utvärdering för närvarande för att gradera embryonal celldelning, cellulärt utseende och andra faktorer. Men denna metod är ofullständig eftersom den inte kan avgöra embryots funktionella egenskaper, eller om det är genetiskt normalt. Det är känt att par med en historia av flera misslyckade IVF-behandlingar producerar ett stort antal embryon som har ett onormalt antal kromosomer (aneuploidi), vilket också är vanligt hos kvinnor över 38 år.

Detta projekt avser att använda preimplantationsgenetisk screening (PGS) med mikroarraytekniken för att bestämma kromosomsammansättningen av befruktade ägg, så att endast kromosomalt normala embryon överförs under IVF. Syftet är att öka sannolikheten för graviditet och förlossning bland par med en historia av upprepade misslyckade IVF-försök. Vi har tidigare genomfört en prospektiv randomiserad studie med en liknande fråga (Ö 612-02) på en målgrupp av äldre kvinnor (>38 år) med provtagning (biopsi) av embryot på dag 3 av odlingen, följt av analys av sju kromosomer par som använder FISH-tekniken. Resultaten av studien visade ingen förbättring av graviditetsresultatet. Anledningarna är troligen 1) till att börja med, normala ägg är sällsynta i denna målgrupp; 2) biopsi utfördes på dag 3 när embryot är i ett känsligt stadium; och 3) endast 7 av totalt 23 kromosompar kunde analyseras.

Metodutvecklingen inom området har varit snabb och nuvarande teknologi möjliggör bättre identifiering av normala embryon jämfört med den tidigare studien.

• Vi vet att embryot är mindre känsligt när en biopsi utförs på dag 5 (av blastocyststadiet) istället för dag 3.
• Vid blastocystbiopsi avlägsnas fler celler för diagnos än vid en dag 3-biopsi (vilket ökar analysens tillförlitlighet).
• Blastocystbiopsi involverar borttagning av färre celler på en procentuell basis (3-5%) från blastocystens totala cellmassa jämfört med den tidigare använda dag 3-biopsien, som innebar borttagning av upp till 25% av det totala antalet celler.
• Blastocyster har en högre implantationshastighet än embryon på dag 3.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) kan nu användas med stor precision för att analysera alla kromosomer med kommersiella kvalitetskontrollerade kit.
• Kryokonservering med förglasning av blastocyster är för närvarande en mycket framgångsrik teknik som gör att analysen kan utföras utan tidspress.

Dessutom kommer vi att vända oss till en patientgrupp bestående av kvinnor med en bevisad normal-god äggstocksreserv. I den tidigare studien som involverade kvinnor >38 år var äggstocksreserven generellt sett dålig.

I förarbetena till lagen om genetisk integritet stod det att PGS skulle "förbehållas tydligt definierade forskningsprojekt som godkänts i en etikprövning av en etisk kommitté." Denna begränsning infördes eftersom kunskapsläget om PGS vid den tiden var mycket begränsat. Mer erfarenhet från forskningsprojekt om PGS ansågs nödvändig för att avgöra om PGS kunde användas i klinisk praxis. Ovan nämnda förarbeten till lagen om genetisk integritet säger också att PGS "kan bli ett viktigt verktyg för att öka chanserna till graviditet i samband med IVF-behandling ...". I detta projekt avser vi att undersöka om det är möjligt att öka chansen till graviditet och förlossning bland par som genomgått flera tidigare misslyckade IVF-försök. Vår hypotes bygger på antagandet att ett felaktigt antal kromosomer ofta är den bakomliggande orsaken till misslyckad implantation eller missfall. För att öka chanserna att etablera en graviditet som leder till förlossning genomför vi en kromosomanalys på embryon hos par för att säkerställa att endast embryon med normal kromosomuppsättning överförs till kvinnan.

Fråga Kan sannolikheten för graviditet och förlossning hos par med flera tidigare misslyckade IVF-försök öka om ett normalt kromosomuppsättning kan säkerställas i embryot innan det överförs? Som kontroll kommer vi att jämföra resultaten av IVF-försök där endast ljusmikroskopisk utvärdering utförs.

Primärt effektmått: Tillförsel per randomiserad patient Sekundära effektmått: Kumulativ graviditetsfrekvens inklusive senare överföring av återstående förglasade blastocyster (högre frekvens förväntas i studiegruppen). Antal missfall under de första 18 veckorna av graviditeten (lägre frekvens förväntas i studiegruppen).

Metoder och material Patienter Par med minst tre misslyckade IVF-försök i anamnesen, där kvinnan är högst 39 år, kommer att bjudas in i samband med sin konsultation för en ny IVF-behandling på någon av IVF Sveriges kliniker att delta. i studien, förutsatt att de uppfyller inklusionskriterierna (inklusive förväntat normalt svar på hormonstimulering med 8-10 ägg). Kvinnorna som går med på att delta i studien kommer att randomiseras (med dator) till antingen biopsi eller kontrollgruppen dagen efter insamling av oocyter om de har minst 5 befruktade ägg (nuvarande procedur för odling dag 5).

Inklusionskriterier: Par som uppfyller kriterierna för IVF-behandling och som har en historia av minst tre tidigare IVF-cykler inklusive embryoöverföring utan förlossning. Kvinnan får vara högst 39 år när studien genomförs och måste ha en normal-god äggstocksreserv (minst 12 antralfolliklar). Hennes partner måste kunna ge ett spermaprov som innehåller levande spermier. Kvinnor som ingår i studien kommer inte att delta i något annat forskningsprojekt.

Uteslutningskriterier: Myom eller andra livmoderskador som bedöms påverka implantationen. Ospecifika cystor som inte anses vara funktionella. Endometrium >3 cm.

Randomisering

Randomisering kommer att ske dag 1 om paret uppfyller de krav som fastställts för odling till blastocyststadiet (minst 5 normalt befruktade oocyter). On-line randomiseringsprogrammet (datoriserat) kommer att balansera följande parametrar:

• Ålder
• Antal uttagna oocyter

Vidare kommer randomiseringsprogrammet vid tidpunkten för randomiseringen att ta hänsyn till att en multicenterstudie är inblandad för att undvika partiskhet.

IVF-behandling Hormonstimulering, ultraljudskontroller, insamling av oocyter och befruktning följer standardproceduren. För kvinnor i kontrollgruppen kommer alla expanderade blastocyster att kryokonserveras (vitrifierade) dag 5-6 för senare överföring. För kvinnor randomiserade till PGS kommer celler (trofektodermceller i embryots yttre cellskikt) att biopsieras dag 5-6, varefter alla biopsierade blastocyster förglasas. Om analysen visar en normal kromosomuppsättning kommer blastocysten att tinas och överföras under nästa menstruationscykel.

Biopsi och cellys Biopsi görs genom att man gör ett hål i skalet på blastocysten (zona pellucida) med hjälp av laserteknik och speciell biopsiutrustning och tar bort 2-5 celler från den yttre cellmassan (trofoblastceller). Cellerna överförs till ett provrör innehållande PBS-lösning. En extraktionslösning tillsätts för att lysera cellerna och DNA:t frisätts i lösningen.

Optimering av genomamplifiering För att optimera protokollet för cellys och helgenomplifiering kommer celler från en embryonal stamcellinje med trisomi 13 samt från en normal karyotyp att användas. Tre, fyra respektive fem celler kommer att pipetteras i PCR-rör. Hela aCGH-protokollet (se nedan) kommer att köras på dessa celler (minst 50 rör), och resultaten kommer att utvärderas. Detta tillvägagångssätt kommer att ge oss en uppfattning om metodens känslighet och hur ofta vi misslyckas med att få resultat på grund av misslyckad amplifiering. Eventuell förorening i systemet kommer också att avslöjas.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Reagens för amplifiering (kopiering) av DNA läggs till DNA-extraktet. Amplifiering utförs i flera steg med användning av en teknik som kallas "Polymerase Chain Reaction" (PCR). Denna process kräver stor noggrannhet och speciella laboratoriefaciliteter så att främmande DNA inte kontaminerar provet. Kontaminering i detta steg kan leda till en felaktig diagnos av embryonas kromosomkonstitution. Det amplifierade DNA:t märks sedan med en fluorescerande molekyl som får DNA:t att fluorescera grönt under UV-belysning. På liknande sätt är normalt kontroll-DNA märkt med en molekyl som fluorescerar rött under UV-belysning. Amplifierat fluorescensmärkt DNA blandas med en lika stor volym av normalt fluorescensmärkt kontroll-DNA. Denna DNA-blandning appliceras på testytor med specifika DNA-sekvenser. Dessa DNA-sekvenser är noggrant utvalda och placerade på testytorna i långa arrayer i en specifik ordning, vilket innebär att DNA från alla kromosomarmar representeras på testytan på specifika platser. Under hybridiseringssteget kommer DNA i DNA-blandningen att tävla om bindning till DNA på testytan. Om det finns lika stora mängder amplifierat DNA (grönt) och kontroll-DNA (rött), kommer lika mycket DNA från båda fraktionerna att binda till testytan. Efter hybridisering, när testytan är upplyst med UV-ljus, kommer den gröna och röda fluorescensen att vara lika intensiv, vilket resulterar i en orange färg (blandning med lika delar av röd och grön färg). Men om det finns ett överskott av DNA från en given kromosom i embryot (t.ex. trisomi), kommer fler DNA-sekvenser från denna kromosom att binda till testytan, vilket resulterar i ett överskott av grön fluorescens i området på testytan som innehåller DNA-sekvenserna från den relevanta kromosomen. På liknande sätt resulterar förlust av en kromosom i ett embryo i en brist på motsvarande DNA i den amplifierade fraktionen, vilket gör att fler kontroll-DNA-sekvenser (röda) binder till testytan. Testområden skannas och resultat bearbetas automatiskt i en datoriserad skanner.

Gradering av embryon:

Utvärdering och gradering av blastocysterna kommer att göras i enlighet med accepterad klassificering enligt Gardner där expansionsgrad, celltäthet och antal celler i den inre cellmassan (IC) och i trophectoderm (TE) bedöms. Alla blastocyster i kontrollgruppen kommer att förglasas för senare överföring. En liknande utvärdering kommer att göras i biopsigruppen före biopsi. Efter biopsi kommer alla biopsierade blastocyster att glaseras.

I den grupp där biopsien utförs kommer mikroarrayanalys att utföras. Överföring görs under den naturliga menstruationscykeln 5 dagar efter ägglossningen. Kvinnor med hormonell störning kräver mild hormonell stimulering innan den förglasade/uppvärmda blastocysten överförs.

Förglasning Efter att blastocysterna har biopsierats kommer de att förglasas och därefter tinas upp enligt väl etablerat protokoll på klinikerna.

Uppföljning Det primära effektmåttet är födsel per randomiserad patient. Sekundära effektmått är kumulativ graviditetsfrekvens, eftersom extra kryokonserverade blastocyster (om några) också överförs, och missfallsfrekvens under de första 18 veckorna av graviditeten (lägre frekvens förväntas i studiegruppen). Vi planerar att skapa en Data Safety Monitoring Board (DSMB) bestående av oberoende externa experter när halva studien är klar.

Uppföljning av alla graviditeter och förlossningar kommer att ske enligt gällande rutin inom IVF.

Statistik Power-analys har visat att för att upptäcka en signifikant skillnad i graviditetsutfall från de uppskattade 15 % i kontrollgruppen till 40 % i PGS-gruppen krävs 112 patienter (alfa=0,8; Beta=0,20). En beräknad attrition på cirka 10 % och den planerade DSMB-analysen innebär att 130 patienter bör rekryteras. DSMB kommer att övervaka studien och ge regelbundna råd om huruvida vi bör fortsätta studien. DSMB-analysen kommer att ge tre rekommendationer: (1) fortsätt studien som planerat, (2) stoppa studien om skillnaden mellan grupperna är mindre än 15 %, (3) fortsätt studien med en större urvalsstorlek. När skillnaden mellan grupperna är 20 % eller större kan studien fortsätta med en större urvalsstorlek (73 patienter i varje grupp. DSMB-analysen kommer att råda dig att fortsätta eller stoppa studien (på grund av mycket signifikant effekt, negativ effekt eller låg villkorlig effekt). kraft. DSMB kan utvärdera både levande födsel och pågående graviditet och väga all information när de ger rekommendationen. DSMB kommer att bestå av specialister som har erfarenhet inom detta område. Statistiska beräkningar kommer att utföras enligt intention-to-treat (ITT), samt per protokoll. ITT är alla randomiserade patienter som har minst 5 befruktade oocyter på dag 1. Vissa patienter kommer sannolikt inte att ha någon överföring på grund av bristen på blastocyster, eller tekniska problem relaterade till förglasning/uppvärmning etc. Därför kommer även analys att göras per protokoll. Logistisk regression kommer att användas i de statistiska beräkningarna och inkluderar stratifieringsvariablerna.