PGS mit Microarray bei IVF-Patienten mit wiederholtem Implantationsversagen

Hintergrund In-vitro-Fertilisation (IVF) ist die wichtigste Methode zur Behandlung von Unfruchtbarkeit, unabhängig davon, ob die Ursache männlich oder weiblich ist oder wenn die Ursache unbekannt ist. Die Behandlung beinhaltet normalerweise die Übertragung einer befruchteten Eizelle (Embryo), die 2-5 Tage lang kultiviert wurde, in die Gebärmutter. Um den Embryo mit den besten Chancen auf eine erfolgreiche Implantation in das Endometrium auszuwählen, wird derzeit eine mikroskopische Bewertung verwendet, um die embryonale Zellteilung, das zelluläre Erscheinungsbild und andere Faktoren zu bewerten. Diese Methode ist jedoch unvollständig, da sie die funktionellen Eigenschaften des Embryos oder seine genetische Normalität nicht bestimmen kann. Es ist bekannt, dass Paare mit einer Vorgeschichte von mehreren erfolglosen IVF-Behandlungen eine große Anzahl von Embryonen produzieren, die eine abnormale Anzahl von Chromosomen (Aneuploidie) aufweisen, was auch bei Frauen über 38 Jahren üblich ist.

Dieses Projekt beabsichtigt, das genetische Präimplantationsscreening (PGS) mit der Microarray-Technik zu verwenden, um die Chromosomenzusammensetzung befruchteter Eizellen zu bestimmen, damit nur chromosomal normale Embryonen während der IVF übertragen werden. Ziel ist es, die Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft und Geburt bei Paaren mit einer Vorgeschichte wiederholter erfolgloser IVF-Versuche zu erhöhen. Wir haben zuvor eine prospektive randomisierte Studie mit einer ähnlichen Fragestellung (Ö 612-02) an einer Zielgruppe älterer Frauen (> 38 Jahre) unter Verwendung einer Entnahme (Biopsie) des Embryos am Tag 3 der Kultur durchgeführt, gefolgt von einer Analyse von sieben Chromosomen Paare mit der FISH-Technik. Die Ergebnisse der Studie zeigten keine Verbesserung des Schwangerschaftsausgangs. Die Gründe sind wahrscheinlich 1) Zunächst einmal sind normale Eier in dieser Zielgruppe selten; 2) die Biopsie wurde am Tag 3 durchgeführt, wenn sich der Embryo in einem sensiblen Stadium befindet; und 3) nur 7 von insgesamt 23 Chromosomenpaaren konnten analysiert werden.

Die methodischen Entwicklungen auf diesem Gebiet waren schnell, und die aktuelle Technologie ermöglicht eine bessere Identifizierung normaler Embryonen im Vergleich zur vorherigen Studie.

• Wir wissen, dass der Embryo weniger empfindlich ist, wenn eine Biopsie am 5. Tag (des Blastozystenstadiums) statt am 3. Tag durchgeführt wird.
• Bei der Blastozystenbiopsie werden mehr Zellen zur Diagnose entnommen als bei einer Biopsie am 3. Tag (wodurch die Zuverlässigkeit der Analyse erhöht wird).
• Bei der Blastozystenbiopsie werden prozentual weniger Zellen (3-5 %) aus der Gesamtzellmasse der Blastozyste entfernt als bei der zuvor verwendeten Tag-3-Biopsie, bei der bis zu 25 % der Gesamtzahl der Zellen entfernt wurden.
• Blastozysten haben eine höhere Implantationsrate als Tag-3-Embryonen.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) kann jetzt mit großer Präzision verwendet werden, um alle Chromosomen mit kommerziellen qualitätskontrollierten Kits zu analysieren.
• Die Kryokonservierung mit Vitrifikation von Blastozysten ist derzeit eine sehr erfolgreiche Technik, die es ermöglicht, die Analyse ohne Zeitdruck durchzuführen.

Darüber hinaus wenden wir uns an eine Patientengruppe bestehend aus Frauen mit nachgewiesener normal-guter ovarieller Reserve. In der vorherigen Studie mit Frauen über 38 Jahren war die ovarielle Reserve im Allgemeinen schlecht.

In den Vorarbeiten zum Genetic Integrity Act heißt es, dass PGS "klar definierten Forschungsprojekten vorbehalten sein sollte, die in einer ethischen Überprüfung durch eine Ethikkommission genehmigt wurden". Diese Einschränkung wurde auferlegt, weil der Kenntnisstand über PGS zu diesem Zeitpunkt sehr begrenzt war. Weitere Erfahrungen aus Forschungsprojekten zu PGS wurden als notwendig erachtet, um festzustellen, ob PGS in der klinischen Praxis eingesetzt werden könnte. In den oben erwähnten Vorarbeiten zum Genetic Integrity Act heißt es auch, dass PGS "ein wichtiges Instrument zur Erhöhung der Schwangerschaftschancen in Verbindung mit einer IVF-Behandlung werden kann ...". In diesem Projekt beabsichtigen wir zu untersuchen, ob es möglich ist, die Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft und Geburt bei Paaren zu erhöhen, die zuvor mehrere gescheiterte IVF-Versuche hinter sich haben. Unsere Hypothese basiert auf der Annahme, dass eine falsche Anzahl von Chromosomen häufig die zugrunde liegende Ursache für eine fehlgeschlagene Implantation oder Fehlgeburt ist. Um die Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft zu erhöhen, die zur Geburt führt, führen wir eine Chromosomenanalyse an den Embryonen von Paaren durch, um sicherzustellen, dass nur Embryonen mit einem normalen Chromosomensatz auf die Frau übertragen werden.

Frage Kann die Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft und Geburt bei Paaren mit mehreren vorangegangenen gescheiterten IVF-Versuchen steigen, wenn ein normaler Chromosomensatz des Embryos vor dem Transfer sichergestellt werden kann? Als Kontrolle vergleichen wir die Ergebnisse von IVF-Versuchen, bei denen nur eine lichtmikroskopische Auswertung durchgeführt wird.

Primärer Endpunkt: Entbindung pro randomisierte Patientin. Sekundäre Endpunkte: Kumulative Schwangerschaftsrate einschließlich späterem Transfer verbleibender vitrifizierter Blastozysten (höhere Rate in der Studiengruppe erwartet). Fehlgeburtsrate während der ersten 18 Schwangerschaftswochen (niedrigere Rate in der Studiengruppe erwartet).

Methoden und Materialien Patienten Paare mit einer Vorgeschichte von mindestens drei erfolglosen IVF-Versuchen, bei denen die Frau maximal 39 Jahre alt ist, werden in Verbindung mit ihrer Beratung für eine neue IVF-Behandlung in einer der IVF-Schweden-Kliniken zur Teilnahme eingeladen an der Studie teilnehmen, sofern sie die Einschlusskriterien erfüllen (einschließlich der erwarteten normalen Reaktion auf die Hormonstimulation mit 8-10 Eizellen). Die Frauen, die der Teilnahme an der Studie zustimmen, werden am Tag nach der Entnahme der Eizellen (per Computer) entweder der Biopsie- oder der Kontrollgruppe randomisiert, wenn sie mindestens 5 befruchtete Eizellen haben (aktuelles Verfahren für die Kultur am Tag 5).

Einschlusskriterien: Paare, die die Kriterien für eine IVF-Behandlung erfüllen und die eine Vorgeschichte von mindestens drei vorherigen IVF-Zyklen haben, einschließlich Embryotransfer ohne Entbindung. Die Frau darf bei Durchführung der Studie maximal 39 Jahre alt sein und muss über eine normal-gute ovarielle Reserve (mindestens 12 Antrumfollikel) verfügen. Ihr Partner muss in der Lage sein, eine Samenprobe mit lebendem Sperma abzugeben. In die Studie eingeschlossene Frauen werden an keinem anderen Forschungsprojekt teilnehmen.

Ausschlusskriterien: Myome oder andere Uterusläsionen, die die Implantation beeinträchtigen könnten. Unspezifische Zysten, die als nicht funktionsfähig angesehen werden. Endometrium > 3 cm.

Randomisierung

Die Randomisierung erfolgt an Tag 1, wenn das Paar die für die Kultur bis zum Blastozystenstadium festgelegten Voraussetzungen erfüllt (mindestens 5 normal befruchtete Eizellen). Das Online-Randomisierungsprogramm (computergestützt) gleicht die folgenden Parameter aus:

• Alter
• Anzahl der entnommenen Eizellen

Darüber hinaus wird das Randomisierungsprogramm zum Zeitpunkt der Randomisierung berücksichtigen, dass es sich um eine multizentrische Studie handelt, um Verzerrungen zu vermeiden.

IVF-Behandlung Hormonstimulation, Ultraschalluntersuchungen, Entnahme der Eizellen und Befruchtung folgen dem Standardverfahren. Bei Frauen in der Kontrollgruppe werden alle expandierten Blastozysten am Tag 5-6 für einen späteren Transfer kryokonserviert (vitrifiziert). Bei Frauen, die zu PGS randomisiert wurden, werden Zellen (Trophektodermzellen in der äußeren Zellschicht des Embryos) an Tag 5-6 biopsiert, wonach alle biopsierten Blastozysten vitrifiziert werden. Wenn die Analyse einen normalen Chromosomensatz zeigt, wird die Blastozyste aufgetaut und während des nächsten Menstruationszyklus übertragen.

Biopsie und Zelllyse Die Biopsie wird durchgeführt, indem mit Lasertechnik und speziellen Biopsiegeräten ein Loch in die Hülle der Blastozyste (Zona pellucida) gebohrt und 2-5 Zellen aus der äußeren Zellmasse (Trophoblastenzellen) entnommen werden. Die Zellen werden in ein Reagenzglas mit PBS-Lösung überführt. Eine Extraktionslösung wird hinzugefügt, um die Zellen zu lysieren, und die DNA wird in die Lösung freigesetzt.

Optimierung der Genom-Amplifikation Zur Optimierung des Protokolls für die Zelllyse und Gesamtgenom-Amplifikation werden Zellen einer embryonalen Stammzelllinie mit Trisomie 13 sowie von einem normalen Karyotyp verwendet. Jeweils drei, vier und fünf Zellen werden in PCR-Röhrchen pipettiert. An diesen Zellen (mindestens 50 Röhrchen) wird das gesamte aCGH-Protokoll (siehe unten) durchlaufen und die Ergebnisse ausgewertet. Dieser Ansatz gibt uns eine Vorstellung von der Empfindlichkeit der Methode und wie oft wir aufgrund erfolgloser Amplifikation keine Ergebnisse erzielen. Eventuelle Verunreinigungen im System werden ebenfalls aufgedeckt.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Reagenz zur Amplifikation (Kopieren) der DNA wird dem DNA-Extrakt zugesetzt. Die Amplifikation wird in mehreren Schritten unter Verwendung einer Technik namens "Polymerase Chain Reaction" (PCR) durchgeführt. Dieser Prozess erfordert große Genauigkeit und spezielle Laboreinrichtungen, damit keine Fremd-DNA die Probe kontaminiert. Eine Kontamination in diesem Schritt könnte zu einer Fehldiagnose der chromosomalen Konstitution der Embryonen führen. Die amplifizierte DNA wird dann mit einem fluoreszierenden Molekül markiert, das die DNA unter UV-Beleuchtung grün fluoreszieren lässt. In ähnlicher Weise wird normale Kontroll-DNA mit einem Molekül markiert, das unter UV-Beleuchtung rot fluoresziert. Amplifizierte fluoreszenzmarkierte DNA wird mit einem gleichen Volumen normaler fluoreszenzmarkierter Kontroll-DNA gemischt. Dieses DNA-Gemisch wird auf Testoberflächen mit spezifischen DNA-Sequenzen aufgetragen. Diese DNA-Sequenzen werden sorgfältig ausgewählt und in einer bestimmten Reihenfolge in langen Arrays auf den Testoberflächen platziert, was bedeutet, dass DNA von allen Chromosomenarmen an bestimmten Stellen auf der Testoberfläche vertreten ist. Während des Hybridisierungsschritts konkurriert die DNA in der DNA-Mischung um die Bindung an die DNA auf der Testoberfläche. Wenn gleiche Mengen an amplifizierter DNA (grün) und Kontroll-DNA (rot) vorhanden sind, bindet eine gleiche Menge DNA aus beiden Fraktionen an die Testoberfläche. Wenn die Testoberfläche nach der Hybridisierung mit UV-Licht beleuchtet wird, sind die grüne und rote Fluoreszenz gleich intensiv, was zu einer orangen Farbe führt (Mischung mit gleichen Anteilen an roter und grüner Farbe). Wenn es jedoch einen Überschuss an DNA von einem bestimmten Chromosom im Embryo gibt (z. B. Trisomie), binden mehr DNA-Sequenzen von diesem Chromosom an die Testoberfläche, was zu einem Überschuss an grüner Fluoreszenz in dem Bereich auf der Testoberfläche führt, der das Chromosom enthält die DNA-Sequenzen des betreffenden Chromosoms. In ähnlicher Weise führt der Verlust eines Chromosoms in einem Embryo zu einem Mangel an der entsprechenden DNA in der amplifizierten Fraktion, wodurch mehr Kontroll-DNA-Sequenzen (rot) an die Testoberfläche binden. Testbereiche werden gescannt und die Ergebnisse automatisch in einem computergestützten Scanner verarbeitet.

Einstufung der Embryonen:

Die Bewertung und Einstufung der Blastozysten erfolgt gemäß der akzeptierten Klassifikation nach Gardner, bei der Expansionsgrad, Zelldichte und Anzahl der Zellen in der inneren Zellmasse (IC) und im Trophektoderm (TE) bewertet werden. Alle Blastozysten in der Kontrollgruppe werden für einen späteren Transfer vitrifiziert. Eine ähnliche Bewertung wird in der Biopsiegruppe vor der Biopsie durchgeführt. Nach der Biopsie werden alle biopsierten Blastozysten vitrifiziert.

In der Gruppe, in der die Biopsie durchgeführt wird, wird eine Microarray-Analyse durchgeführt. Der Transfer erfolgt während des natürlichen Menstruationszyklus 5 Tage nach dem Eisprung. Frauen mit hormonellen Störungen benötigen vor dem Transfer der vitrifizierten/erwärmten Blastozyste eine leichte hormonelle Stimulation.

Vitrifikation Nachdem die Blastozysten biopsiert wurden, werden sie vitrifiziert und anschließend gemäß den etablierten Protokollen in den Kliniken aufgetaut.

Nachsorge Der primäre Endpunkt ist die Geburt pro randomisierte Patientin. Sekundäre Endpunkte sind die kumulative Schwangerschaftsrate, da zusätzlich kryokonservierte Blastozysten (falls vorhanden) ebenfalls übertragen werden, und die Fehlgeburtsrate während der ersten 18 Schwangerschaftswochen (niedrigere Rate in der Studiengruppe erwartet). Wir planen, nach der Hälfte der Studie ein Data Safety Monitoring Board (DSMB) einzurichten, das sich aus unabhängigen externen Experten zusammensetzt.

Die Nachsorge aller Schwangerschaften und Geburten wird gemäß dem aktuellen Verfahren innerhalb der IVF durchgeführt.

Die Statistik-Power-Analyse hat gezeigt, dass zum Nachweis eines signifikanten Unterschieds im Schwangerschaftsausgang von den geschätzten 15 % in der Kontrollgruppe zu 40 % in der PGS-Gruppe 112 Patientinnen (Alpha = 0,8; Beta=0,20). Eine geschätzte Fluktuationsrate von etwa 10 % und die geplante DSMB-Analyse bedeuten, dass 130 Patienten rekrutiert werden sollten. Das DSMB wird die Studie überwachen und regelmäßig beraten, ob wir die Studie fortsetzen sollten. Die DSMB-Analyse wird 3 Empfehlungen geben: (1) die Studie wie geplant fortsetzen, (2) die Studie beenden, wenn der Unterschied zwischen den Gruppen weniger als 15 % beträgt, (3) die Studie mit einer größeren Stichprobengröße fortsetzen. Wenn der Unterschied zwischen den Gruppen 20 % oder mehr beträgt, kann die Studie mit einer größeren Stichprobengröße fortgesetzt werden (73 Patienten in jeder Gruppe). Leistung. DSMB kann sowohl Lebendgeburten als auch laufende Schwangerschaften bewerten und alle Informationen abwägen, wenn sie die Empfehlung geben. Das DSMB wird aus Spezialisten bestehen, die auf diesem Gebiet erfahren sind. Statistische Berechnungen werden gemäß Intention-to-treat (ITT) sowie gemäß Protokoll durchgeführt . ITT sind alle randomisierten Patientinnen mit mindestens 5 befruchteten Eizellen am Tag 1. Bei einigen Patienten ist aufgrund fehlender Blastozysten oder technischer Probleme in Bezug auf Vitrifikation/Erwärmung usw. wahrscheinlich kein Transfer möglich. Daher wird die Analyse auch pro Protokoll durchgeführt. Die logistische Regression wird in den statistischen Berechnungen verwendet und schließt die Schichtungsvariablen ein.