PGS che utilizza il microarray nei pazienti con fecondazione in vitro con ripetuti fallimenti di impianto

Contesto La fecondazione in vitro (IVF) è il metodo più importante per porre rimedio all'infertilità, sia che la causa sia maschile o femminile, o quando la causa è sconosciuta. Il trattamento di solito prevede il trasferimento nell'utero di un uovo fecondato (embrione) che è stato coltivato per 2-5 giorni. Per selezionare l'embrione con le migliori possibilità di impianto riuscito nell'endometrio, la valutazione microscopica viene attualmente utilizzata per classificare la divisione cellulare embrionale, l'aspetto cellulare e altri fattori. Ma questo metodo è incompleto perché non può determinare le proprietà funzionali dell'embrione o se è geneticamente normale. È noto che le coppie con una storia di molteplici trattamenti di fecondazione in vitro senza successo producono un gran numero di embrioni con un numero anormale di cromosomi (aneuploidia), che è comune anche nelle donne di età superiore ai 38 anni.

Questo progetto intende utilizzare lo screening genetico preimpianto (PGS) con la tecnica del microarray per determinare la composizione cromosomica degli ovuli fecondati, in modo che durante la fecondazione in vitro vengano trasferiti solo embrioni cromosomicamente normali. Lo scopo è aumentare la probabilità di gravidanza e parto tra le coppie con una storia di ripetuti tentativi falliti di fecondazione in vitro. Abbiamo precedentemente condotto uno studio prospettico randomizzato con una domanda simile (Ö 612-02) su un gruppo target di donne anziane (>38 anni) utilizzando il campionamento (biopsia) dell'embrione il giorno 3 della coltura, seguito dall'analisi di sette cromosomi coppie utilizzando la tecnica FISH. I risultati dello studio non hanno mostrato alcun miglioramento nell'esito della gravidanza. Le ragioni sono probabilmente 1) per cominciare, le uova normali sono poco frequenti in questo gruppo target; 2) la biopsia è stata eseguita il giorno 3 quando l'embrione è in una fase sensibile; e 3) è stato possibile analizzare solo 7 coppie di cromosomi su un totale di 23.

Gli sviluppi metodologici nel campo sono stati rapidi e la tecnologia attuale consente una migliore identificazione degli embrioni normali rispetto allo studio precedente.

• Sappiamo che l'embrione è meno sensibile quando una biopsia viene eseguita il giorno 5 (dello stadio di blastocisti) invece del giorno 3.
• Nella biopsia della blastocisti, vengono rimosse più cellule per la diagnosi rispetto a una biopsia del giorno 3 (aumentando così l'affidabilità dell'analisi).
• La biopsia della blastocisti comporta la rimozione di un numero inferiore di cellule su base percentuale (3-5%) dalla massa cellulare totale della blastocisti rispetto alla biopsia del giorno 3 utilizzata in precedenza, che comportava la rimozione fino al 25% del numero totale di cellule.
• Le blastocisti hanno un tasso di impianto più elevato rispetto agli embrioni del terzo giorno.
• L'array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) può ora essere utilizzato con grande precisione per analizzare tutti i cromosomi utilizzando kit commerciali di qualità controllata.
• La crioconservazione con vetrificazione delle blastocisti è attualmente una tecnica di grande successo che consente di condurre l'analisi senza essere a corto di tempo.

Inoltre, ci rivolgeremo a un gruppo di pazienti composto da donne con comprovata riserva ovarica normale-buona. Nello studio precedente che coinvolgeva donne > 38 anni, la riserva ovarica era generalmente scarsa.

Il lavoro preparatorio per il Genetic Integrity Act affermava che PGS dovrebbe "essere riservato a progetti di ricerca chiaramente definiti approvati in una revisione etica da un comitato etico". Questa restrizione è stata imposta perché lo stato delle conoscenze sui PGS in quel momento era molto limitato. È stata ritenuta necessaria una maggiore esperienza dai progetti di ricerca sulla PGS per determinare se la PGS potesse essere utilizzata nella pratica clinica. Il suddetto lavoro preparatorio per il Genetic Integrity Act afferma inoltre che PGS "può diventare uno strumento importante per aumentare le possibilità di gravidanza in combinazione con il trattamento di fecondazione in vitro ...". In questo progetto, intendiamo indagare se sia possibile aumentare la possibilità di gravidanza e parto tra le coppie che hanno subito diversi precedenti tentativi falliti di fecondazione in vitro. La nostra ipotesi si basa sul presupposto che un numero errato di cromosomi sia spesso la causa sottostante di impianto fallito o aborto spontaneo. Per aumentare le possibilità di stabilire una gravidanza che porti al parto, stiamo conducendo un'analisi cromosomica sugli embrioni delle coppie per garantire che alla donna vengano trasferiti solo embrioni con un set cromosomico normale.

Domanda Può aumentare la probabilità di gravidanza e parto in coppie con diversi precedenti tentativi falliti di fecondazione in vitro se è possibile garantire un set cromosomico normale nell'embrione prima del suo trasferimento? Come controllo, confronteremo i risultati dei tentativi di fecondazione in vitro in cui viene eseguita solo la valutazione microscopica della luce.

Endpoint primario: parto per paziente randomizzato Endpoint secondari: tasso di gravidanza cumulativo incluso il successivo trasferimento delle rimanenti blastocisti vetrificate (tasso più alto previsto nel gruppo di studio). Tasso di aborto spontaneo durante le prime 18 settimane di gravidanza (tasso inferiore previsto nel gruppo di studio).

Metodi e materiali Pazienti Le coppie con una storia di almeno tre tentativi falliti di fecondazione in vitro, in cui la donna ha un'età massima di 39 anni, saranno invitate in concomitanza con la loro consultazione per un nuovo trattamento di fecondazione in vitro presso una delle cliniche di fecondazione in vitro a partecipare nello studio, a condizione che soddisfino i criteri di inclusione (inclusa la risposta normale prevista alla stimolazione ormonale con 8-10 uova). Le donne che accettano di partecipare allo studio saranno randomizzate (tramite computer) alla biopsia o al gruppo di controllo il giorno dopo la raccolta degli ovociti se hanno almeno 5 ovuli fecondati (procedura attuale per la coltura il giorno 5).

Criteri di inclusione: coppie che soddisfano i criteri per il trattamento di fecondazione in vitro e che hanno una storia di almeno tre precedenti cicli di fecondazione in vitro, incluso il trasferimento di embrioni senza parto. La donna può avere un'età massima di 39 anni al momento dell'esecuzione dello studio e deve avere una riserva ovarica normale-buona (almeno 12 follicoli antrali). Il suo partner deve essere in grado di fornire un campione di sperma contenente sperma vivo. Le donne incluse nello studio non parteciperanno a nessun altro progetto di ricerca.

Criteri di esclusione: mioma o altre lesioni uterine giudicate in grado di influenzare l'impianto. Cisti non specifiche che non sono considerate funzionali. Endometrio >3 cm.

Randomizzazione

La randomizzazione avverrà il giorno 1 se la coppia soddisfa i requisiti stabiliti per la coltura allo stadio di blastocisti (almeno 5 ovociti normalmente fecondati). Il programma di randomizzazione on-line (informatizzato) bilancerà i seguenti parametri:

• Età
• Numero di ovociti recuperati

Inoltre, al momento della randomizzazione, il programma di randomizzazione terrà conto del coinvolgimento di uno studio multicentrico per evitare bias.

Trattamento IVF La stimolazione ormonale, i controlli ecografici, la raccolta degli ovociti e la fecondazione seguiranno la procedura standard. Per le donne nel gruppo di controllo, tutte le blastocisti espanse saranno criopreservate (vetrificate) il giorno 5-6 per il successivo trasferimento. Per le donne randomizzate a PGS, le cellule (cellule del trofectoderma nello strato cellulare esterno dell'embrione) saranno sottoposte a biopsia il giorno 5-6, dopodiché tutte le blastocisti sottoposte a biopsia saranno vetrificate. Se l'analisi mostra un set cromosomico normale, la blastocisti verrà scongelata e trasferita durante il successivo ciclo mestruale.

Biopsia e lisi cellulare La biopsia viene eseguita praticando un foro nel guscio della blastocisti (zona pellucida) utilizzando la tecnologia laser e speciali apparecchiature per biopsia e rimuovendo 2-5 cellule dalla massa cellulare esterna (cellule del trofoblasto). Le cellule vengono trasferite in una provetta contenente soluzione PBS. Viene aggiunta una soluzione di estrazione per lisare le cellule e il DNA viene rilasciato nella soluzione.

Ottimizzazione dell'amplificazione del genoma Per ottimizzare il protocollo per la lisi cellulare e l'amplificazione dell'intero genoma, verranno utilizzate cellule provenienti da una linea di cellule staminali embrionali con trisomia 13 e da un cariotipo normale. Tre, quattro e cinque celle rispettivamente saranno pipettate in provette per PCR. L'intero protocollo aCGH (vedi sotto) verrà eseguito su queste cellule (almeno 50 provette) e verranno valutati i risultati. Questo approccio ci fornirà un'idea della sensibilità del metodo e della frequenza con cui non riusciamo a ottenere risultati a causa di un'amplificazione non riuscita. Verrà rivelata anche la contaminazione nel sistema, se presente.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Il reagente per l'amplificazione (copia) del DNA viene aggiunto all'estratto di DNA. L'amplificazione viene eseguita in più fasi utilizzando una tecnica chiamata "reazione a catena della polimerasi" (PCR). Questo processo richiede grande accuratezza e attrezzature di laboratorio speciali in modo che il DNA estraneo non contamini il campione. La contaminazione in questa fase potrebbe portare a una diagnosi errata della costituzione cromosomica degli embrioni. Il DNA amplificato viene quindi etichettato con una molecola fluorescente che fa sì che il DNA diventi verde fluorescente sotto l'illuminazione UV. Allo stesso modo, il normale DNA di controllo è etichettato con una molecola che emette fluorescenza rossa sotto l'illuminazione UV. Il DNA amplificato marcato con fluorescenza viene miscelato con un volume uguale di normale DNA di controllo marcato con fluorescenza. Questa miscela di DNA viene applicata su superfici di test con sequenze di DNA specifiche. Queste sequenze di DNA vengono accuratamente selezionate e posizionate sulle superfici del test in lunghe serie in un ordine specifico, il che significa che il DNA di tutti i bracci cromosomici è rappresentato sulla superficie del test in posizioni specifiche. Durante la fase di ibridazione, il DNA nella miscela di DNA competerà per legarsi al DNA sulla superficie del test. Se sono presenti quantità uguali di DNA amplificato (verde) e DNA di controllo (rosso), allora una quantità uguale di DNA di entrambe le frazioni si legherà alla superficie del test. Dopo l'ibridazione, quando la superficie del test viene illuminata con luce UV, la fluorescenza verde e rossa sarà ugualmente intensa, risultando in un colore arancione (miscela con parti uguali di colore rosso e verde). Tuttavia, se c'è un eccesso di DNA di un determinato cromosoma nell'embrione (ad es. trisomia), più sequenze di DNA di questo cromosoma si legheranno alla superficie del test, determinando un eccesso di fluorescenza verde nell'area sulla superficie del test contenente le sequenze di DNA dal cromosoma pertinente. Allo stesso modo, la perdita di un cromosoma in un embrione comporta una carenza del DNA corrispondente nella frazione amplificata, causando il legame di più sequenze di DNA di controllo (rosso) alla superficie del test. Le aree di test vengono scansionate ei risultati elaborati automaticamente in uno scanner computerizzato.

Classificazione degli embrioni:

La valutazione e la classificazione delle blastocisti sarà effettuata secondo la classificazione accettata secondo Gardner in cui vengono valutati il ​​grado di espansione, la densità cellulare e il numero di cellule nella massa cellulare interna (IC) e nel trofectoderma (TE). Tutte le blastocisti nel gruppo di controllo saranno vetrificate per il successivo trasferimento. Una valutazione simile sarà effettuata nel gruppo biopsia prima della biopsia. Dopo la biopsia, tutte le blastocisti biopsiate saranno vetrificate.

Nel gruppo in cui viene condotta la biopsia verrà effettuata l'analisi dei microarray. Il trasferimento viene effettuato durante il ciclo mestruale naturale 5 giorni dopo l'ovulazione. Le donne con disturbi ormonali richiedono una lieve stimolazione ormonale prima del trasferimento della blastocisti vetrificata/riscaldata.

Vetrificazione Dopo che le blastocisti sono state sottoposte a biopsia, saranno vetrificate e successivamente scongelate secondo il protocollo ben stabilito presso le cliniche.

Follow-up L'endpoint primario è la nascita per paziente randomizzato. Gli endpoint secondari sono il tasso di gravidanza cumulativo, poiché vengono trasferite anche blastocisti extra crioconservate (se presenti) e il tasso di aborto spontaneo durante le prime 18 settimane di gravidanza (tasso inferiore previsto nel gruppo di studio). Abbiamo in programma di creare un Data Safety Monitoring Board (DSMB) composto da esperti esterni indipendenti quando metà dello studio sarà stato completato.

Il follow-up di tutte le gravidanze e dei parti sarà effettuato secondo la procedura corrente nell'ambito della fecondazione in vitro.

L'analisi della potenza statistica ha dimostrato che per rilevare una differenza significativa negli esiti della gravidanza dal 15% stimato nel gruppo di controllo al 40% nel gruppo PGS sono necessarie 112 pazienti (alfa=0,8; beta=0,20). Un tasso di abbandono stimato di circa il 10% e l'analisi DSMB pianificata significano che dovrebbero essere reclutati 130 pazienti. Il DSMB monitorerà lo studio e fornirà consigli periodici sull'opportunità di continuare lo studio. L'analisi DSMB fornirà 3 raccomandazioni: (1) continuare lo studio come previsto, (2) interrompere lo studio se la differenza tra i gruppi è inferiore al 15%, (3) continuare lo studio con una dimensione del campione maggiore. Quando la differenza tra i gruppi è pari o superiore al 20%, lo studio può essere continuato con un campione più ampio (73 pazienti in ciascun gruppo). L'analisi DSMB consiglierà di continuare o interrompere lo studio (a causa di un effetto altamente significativo, effetto negativo o basso energia. DSMB può valutare sia la nascita viva che la gravidanza in corso e soppesare tutte le informazioni quando danno la raccomandazione. Il DSMB sarà composto da specialisti esperti in questo campo. I calcoli statistici saranno effettuati secondo l'intenzione di trattare (ITT), nonché per protocollo. ITT sono tutti pazienti randomizzati, con almeno 5 ovociti fecondati il ​​giorno 1. È probabile che alcuni pazienti non abbiano trasferimento a causa della mancanza di blastocisti, o problemi tecnici relativi alla vetrificazione/riscaldamento, ecc. Pertanto, l'analisi verrà eseguita anche per protocollo. La regressione logistica sarà utilizzata nei calcoli statistici e includerà le variabili di stratificazione.