PGS bruger mikroarray hos IVF-patienter med gentagen implantationsfejl

Baggrund In vitro fertilisering (IVF) er den vigtigste metode til at afhjælpe infertilitet, uanset om årsagen er manden eller kvinden, eller når årsagen er ukendt. Behandlingen involverer normalt overførsel til livmoderen af ​​et befrugtet æg (embryo), der har været dyrket i 2-5 dage. For at vælge det embryo, der har den bedste chance for vellykket implantation i endometriet, bruges mikroskopisk evaluering i øjeblikket til at gradere embryonal celledeling, cellulært udseende og andre faktorer. Men denne metode er ufuldstændig, fordi den ikke kan bestemme embryonets funktionelle egenskaber, eller om det er genetisk normalt. Det er kendt, at par med en historie med flere mislykkede IVF-behandlinger producerer et stort antal embryoner, der har et unormalt antal kromosomer (aneuploidi), hvilket også er almindeligt hos kvinder over 38 år.

Dette projekt har til hensigt at anvende præimplantation genetisk screening (PGS) med mikroarray-teknikken til at bestemme kromosomsammensætningen af ​​befrugtede æg, således at kun kromosomalt normale embryoner overføres under IVF. Formålet er at øge sandsynligheden for graviditet og fødsel blandt par med en historie med gentagne mislykkede IVF-forsøg. Vi har tidligere udført et prospektivt randomiseret studie med et lignende spørgsmål (Ö 612-02) på en målgruppe af ældre kvinder (>38 år) ved hjælp af prøveudtagning (biopsi) af embryonet på dag 3 af dyrkning, efterfulgt af analyse af syv kromosomer par ved hjælp af FISH-teknikken. Resultaterne af undersøgelsen viste ingen forbedring i graviditetsresultatet. Årsagerne er formentlig 1) til at begynde med er normale æg sjældne i denne målgruppe; 2) biopsien blev udført på dag 3, når embryonet er på et følsomt stadie; og 3) kun 7 ud af i alt 23 kromosompar kunne analyseres.

Metodeudviklingen på området har været hurtig, og den nuværende teknologi giver mulighed for bedre identifikation af normale embryoner sammenlignet med den tidligere undersøgelse.

• Vi ved, at embryoet er mindre følsomt, når en biopsi udføres på dag 5 (i blastocyststadiet) i stedet for dag 3.
• Ved blastocystbiopsi fjernes flere celler til diagnosticering end ved en dag 3 biopsi (hvorved analysens pålidelighed øges).
• Blastocystbiopsi involverer fjernelse af færre celler på procentbasis (3-5 %) fra blastocystens samlede cellemasse sammenlignet med den tidligere anvendte dag 3-biopsi, som involverede fjernelse af op til 25 % af det samlede antal celler.
• Blastocyster har en højere implantationshastighed end embryoner på dag 3.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) kan nu bruges med stor præcision til at analysere alle kromosomer ved hjælp af kommercielle kvalitetskontrollerede kits.
• Kryokonservering med forglasning af blastocyster er i øjeblikket en meget vellykket teknik, der gør det muligt at udføre analysen uden tidspress.

Derudover vil vi henvende os til en patientgruppe bestående af kvinder med en dokumenteret normal-god ovariereserve. I den tidligere undersøgelse, der involverede kvinder >38 år, var ovariereserven generelt dårlig.

I forarbejderne til lov om genetisk integritet stod der, at PGS skulle "forbeholdes klart definerede forskningsprojekter godkendt i en etisk gennemgang af en etisk komité." Denne begrænsning blev pålagt, fordi viden om PGS på det tidspunkt var meget begrænset. Mere erfaring fra forskningsprojekter om PGS blev anset for nødvendig for at afgøre, om PGS kunne anvendes i klinisk praksis. Ovennævnte forarbejder til loven om genetisk integritet siger også, at PGS "kan blive et vigtigt redskab til at øge chancerne for graviditet i forbindelse med IVF-behandling ...". I dette projekt har vi til hensigt at undersøge, om det er muligt at øge chancen for graviditet og fødsel blandt par, der har gennemgået flere tidligere mislykkede IVF-forsøg. Vores hypotese er baseret på den antagelse, at et forkert antal kromosomer ofte er den underliggende årsag til mislykket implantation eller abort. For at øge chancerne for at etablere en graviditet, der fører til fødsel, gennemfører vi en kromosomanalyse på pars embryoner for at sikre, at kun embryoner med et normalt kromosomsæt overføres til kvinden.

Spørgsmål Kan sandsynligheden for graviditet og fødsel hos par med flere tidligere mislykkede IVF-forsøg øges, hvis der kan sikres et normalt kromosomsæt i embryonet, inden det overføres? Som kontrol vil vi sammenligne resultaterne af IVF-forsøg, hvor der kun udføres lysmikroskopisk evaluering.

Primært endepunkt: Levering pr. randomiseret patient Sekundære endepunkter: Kumulativ graviditetsrate inklusive senere overførsel af resterende forglasede blastocyster (højere rate forventet i undersøgelsesgruppen). Abortrate i løbet af de første 18 uger af graviditeten (lavere rate forventet i undersøgelsesgruppen).

Metoder og materialer Patienter Par med en historie på mindst tre mislykkede IVF-forsøg, hvor kvinden maksimalt er 39 år, vil i forbindelse med deres konsultation blive inviteret til en ny IVF-behandling på en af ​​IVF Sveriges klinikker til at deltage i undersøgelsen, forudsat at de opfylder inklusionskriterierne (herunder forventet normal respons på hormonstimulering med 8-10 æg). De kvinder, der takker ja til at deltage i undersøgelsen, vil blive randomiseret (via computer) til enten biopsi eller kontrolgruppen dagen efter opsamling af oocytter, hvis de har mindst 5 befrugtede æg (nuværende procedure for dyrkning på dag 5).

Inklusionskriterier: Par, der opfylder kriterierne for IVF-behandling, og som har en historie med mindst tre tidligere IVF-cyklusser inklusive embryooverførsel uden levering. Kvinden må højst være 39 år, når undersøgelsen udføres og skal have en normal-god ovariereserve (mindst 12 antralfollikler). Hendes partner skal kunne levere en sædprøve indeholdende levende sæd. Kvinder inkluderet i undersøgelsen vil ikke deltage i noget andet forskningsprojekt.

Eksklusionskriterier: Myom eller andre uteruslæsioner, der vurderes at påvirke implantationen. Uspecifikke cyster, der ikke anses for at være funktionelle. Endometrium >3 cm.

Randomisering

Randomisering vil finde sted på dag 1, hvis parret opfylder de fastsatte krav til dyrkning til blastocyststadiet (mindst 5 normalt befrugtede oocytter). Online-randomiseringsprogrammet (computeriseret) vil balancere følgende parametre:

• Alder
• Antal udvundne oocytter

Endvidere vil randomiseringsprogrammet på randomiseringstidspunktet tage højde for, at et multicenterstudie er involveret for at undgå bias.

IVF-behandling Hormonstimulering, ultralydstjek, opsamling af oocytter og befrugtning vil følge standardproceduren. For kvinder i kontrolgruppen vil alle ekspanderede blastocyster blive kryokonserveret (vitrificeret) dag 5-6 til senere overførsel. For kvinder randomiseret til PGS vil celler (trophectoderm celler i det ydre cellelag af embryonet) blive biopsieret på dag 5-6, hvorefter alle biopsiede blastocyster vil blive forglasset. Hvis analysen viser et normalt kromosomsæt, vil blastocysten blive optøet og overført i løbet af den næste menstruationscyklus.

Biopsi og cellelyse Biopsien udføres ved at lave et hul i skallen på blastocysten (zona pellucida) ved hjælp af laserteknologi og særligt biopsiudstyr og fjerne 2-5 celler fra den ydre cellemasse (trofoblastceller). Cellerne overføres til et reagensglas indeholdende PBS-opløsning. En ekstraktionsopløsning tilsættes for at lysere cellerne, og DNA'et frigives i opløsningen.

Optimering af genomamplifikation For at optimere protokollen for cellelyse og helgenomamplifikation vil celler fra en embryonal stamcellelinje med trisomi 13 samt fra en normal karyotype blive brugt. Tre, fire og fem celler vil blive pipetteret i PCR-rør. Hele aCGH-protokollen (se nedenfor) vil blive kørt på disse celler (mindst 50 rør), og resultaterne vil blive evalueret. Denne tilgang vil give os en idé om metodens følsomhed, og hvor ofte vi ikke opnår resultater på grund af mislykket amplifikation. Eventuel forurening i systemet vil også blive afsløret.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH)-reagens til amplifikation (kopiering) af DNA'et tilsættes til DNA-ekstraktet. Amplifikation udføres i flere trin ved hjælp af en teknik kaldet "Polymerase Chain Reaction" (PCR). Denne proces kræver stor nøjagtighed og specielle laboratoriefaciliteter, så fremmed DNA ikke forurener prøven. Kontaminering på dette trin kan føre til en fejldiagnose af embryonernes kromosomsammensætning. Det amplificerede DNA mærkes derefter med et fluorescerende molekyle, som får DNA'et til at fluorescere grønt under UV-belysning. På samme måde er normalt kontrol-DNA mærket med et molekyle, der fluorescerer rødt under UV-belysning. Amplificeret fluorescensmærket DNA blandes med et lige så stort volumen normalt fluorescensmærket kontrol-DNA. Denne DNA-blanding påføres testoverflader med specifikke DNA-sekvenser. Disse DNA-sekvenser udvælges omhyggeligt og placeres på testfladerne i lange arrays i en bestemt rækkefølge, hvilket betyder, at DNA fra alle kromosomarme er repræsenteret på testoverfladen på bestemte steder. Under hybridiseringstrinnet vil DNA'et i DNA-blandingen konkurrere om binding til DNA'et på testoverfladen. Hvis der er lige store mængder amplificeret DNA (grønt) og kontrol-DNA (rødt), så vil en lige stor mængde DNA fra begge fraktioner binde til testoverfladen. Efter hybridisering, når testoverfladen er belyst med UV-lys, vil den grønne og røde fluorescens være lige intens, hvilket resulterer i en orange farve (blanding med lige store portioner af rød og grøn farve). Men hvis der er et overskud af DNA fra et givet kromosom i embryonet (f.eks. trisomi), vil flere DNA-sekvenser fra dette kromosom binde til testoverfladen, hvilket resulterer i et overskud af grøn fluorescens i området på testoverfladen, der indeholder DNA-sekvenserne fra det relevante kromosom. Tilsvarende resulterer tab af et kromosom i et embryo i en mangel på det tilsvarende DNA i den amplificerede fraktion, hvilket får flere kontrol-DNA-sekvenser (røde) til at binde til testoverfladen. Testområder scannes og resultater behandles automatisk i en computeriseret scanner.

Gradering af embryoner:

Evaluering og gradering af blastocysterne vil blive foretaget i overensstemmelse med accepteret klassificering i henhold til Gardner, hvor udvidelsesgrad, celletæthed og antal celler i den indre cellemasse (IC) og i trophectoderm (TE) vurderes. Alle blastocyster i kontrolgruppen vil blive forglasset til senere overførsel. En lignende evaluering vil blive udført i biopsigruppen forud for biopsien. Efter biopsi vil alle biopsiede blastocyster blive forglasset.

I den gruppe, hvor biopsien udføres, vil der blive udført mikroarray-analyse. Overførsel sker under den naturlige menstruationscyklus 5 dage efter ægløsning. Kvinder med hormonforstyrrelser kræver mild hormonstimulering før overførsel af den forglasede/opvarmede blastocyst.

Forglasning Efter at blastocysterne er blevet biopsieret, vil de blive forglasset og efterfølgende optøet i henhold til veletableret protokol på klinikkerne.

Opfølgning Det primære endepunkt er fødsel pr. randomiseret patient. Sekundære endepunkter er kumulativ graviditetsrate, da ekstra kryokonserverede blastocyster (hvis nogen) også overføres, og abortrate i løbet af de første 18 uger af graviditeten (lavere rate forventet i undersøgelsesgruppen). Vi planlægger at oprette et Data Safety Monitoring Board (DSMB) bestående af uafhængige eksterne eksperter, når halvdelen af ​​undersøgelsen er afsluttet.

Der vil blive fulgt op på alle graviditeter og fødsler efter gældende procedure indenfor IVF.

Statistisk Power-analyse har vist, at for at påvise en signifikant forskel i graviditetsresultater fra de anslåede 15 % i kontrolgruppen til 40 % i PGS-gruppen kræves 112 patienter (alfa=0,8; Beta=0,20). En estimeret nedslidning på omkring 10 % og den planlagte DSMB-analyse betyder, at 130 patienter bør rekrutteres. DSMB vil overvåge undersøgelsen og give periodisk rådgivning om, hvorvidt vi skal fortsætte undersøgelsen. DSMB-analysen vil give 3 anbefalinger: (1) fortsæt undersøgelsen som planlagt, (2) stop undersøgelsen, hvis forskellen mellem grupperne er mindre end 15 %, (3) fortsæt undersøgelsen med en større stikprøvestørrelse. Når forskellen mellem grupperne er 20 % eller større, kan undersøgelsen fortsættes med en større stikprøvestørrelse (73 patienter i hver gruppe DSMB-analysen vil rådgive om at fortsætte eller stoppe undersøgelsen (på grund af meget signifikant effekt, negativ effekt eller lav betinget effekt). strøm. DSMB kan evaluere både levendefødte og igangværende graviditet og veje al information, når de giver anbefalingen. DSMB vil bestå af specialister med erfaring på dette område. Statistiske beregninger vil blive udført i henhold til intention-to-treat (ITT), samt pr protokol. ITT er alle randomiserede patienter, der har mindst 5 befrugtede oocytter på dag 1. Nogle patienter vil sandsynligvis ikke have nogen overførsel på grund af manglen på blastocyster eller tekniske problemer i forbindelse med forglasning/opvarmning osv. Derfor vil der også blive analyseret pr protokol. Logistisk regression vil blive brugt i de statistiske beregninger og inkludere stratifikationsvariablerne.