PGS Microarray használata ismétlődő beültetési kudarcban szenvedő IVF-betegeknél

Háttér Az in vitro megtermékenyítés (IVF) a legfontosabb módszer a meddőség orvoslására, függetlenül attól, hogy az ok férfi vagy nő, vagy ha az ok ismeretlen. A kezelés általában magában foglalja a 2-5 napig tenyésztett megtermékenyített petesejt (embrió) méhbe történő átvitelét. Az endometriumba történő sikeres beültetés legjobb esélyével rendelkező embrió kiválasztásához jelenleg mikroszkópos értékelést alkalmaznak az embrionális sejtosztódás, a sejtmegjelenés és egyéb tényezők minősítésére. Ez a módszer azonban nem teljes, mert nem tudja meghatározni az embrió funkcionális tulajdonságait, vagy azt, hogy genetikailag normális-e. Ismeretes, hogy a többszörös sikertelen IVF-kezelésen átesett párok nagyszámú embriót hoznak létre, amelyek rendellenes kromoszómákkal rendelkeznek (aneuploidia), ami szintén gyakori a 38 év feletti nőknél.

Ez a projekt a preimplantációs genetikai szűrést (PGS) kívánja alkalmazni a microarray technikával a megtermékenyített pete kromoszóma összetételének meghatározására, így az IVF során csak kromoszómálisan normális embriók kerülhetnek át. A cél a terhesség és a szülés valószínűségének növelése olyan párok körében, akiknek a kórtörténetében ismétlődő sikertelen IVF-kísérlet szerepel. Korábban végeztünk egy prospektív randomizált vizsgálatot hasonló kérdéssel (Ö 612-02) idősebb (38 év feletti) nők célcsoportján, az embrió mintavételével (biopszia) a tenyésztés 3. napján, majd hét kromoszóma elemzésével. párokat FISH technikával. A vizsgálat eredményei nem mutattak javulást a terhesség kimenetelében. Az okok valószínűleg a következők: 1) először is, ebben a célcsoportban ritka a normál tojás; 2) a biopsziát a 3. napon végezték, amikor az embrió érzékeny stádiumban van; és 3) az összesen 23 kromoszómapárból csak 7 volt elemezhető.

A területen a módszertani fejlődés gyors volt, és a jelenlegi technológia lehetővé teszi a normál embriók jobb azonosítását az előző tanulmányhoz képest.

• Tudjuk, hogy az embrió kevésbé érzékeny, ha a biopsziát az 5. napon (a blasztociszta stádiumában) végzik el a 3. nap helyett.
• A blasztociszta biopsziában több sejtet távolítanak el a diagnózishoz, mint a 3. napi biopszia során (ezáltal nő az elemzés megbízhatósága).
• A blasztociszta biopszia azt jelenti, hogy a blasztociszta teljes sejttömegéből százalékosan kevesebb sejtet távolítanak el (3-5%), összehasonlítva a korábban használt 3. napi biopsziával, amely a teljes sejtszám akár 25%-ának eltávolítását jelentette.
• A blastociszták beágyazódási aránya magasabb, mint a 3. napi embriók.
• Az Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) most már nagy pontossággal használható az összes kromoszóma elemzésére kereskedelmi minőség-ellenőrzött készletek segítségével.
• A blasztociszták vitrifikálásával történő mélyhűtés jelenleg egy nagyon sikeres technika, amely lehetővé teszi az elemzés elvégzését anélkül, hogy az idő rászorulna.

Emellett egy olyan betegcsoporthoz is fordulunk, amely olyan nőkből áll, akiknek bizonyítottan normális-jó petefészek-tartalékuk van. Az előző, 38 év feletti nők bevonásával végzett vizsgálatban a petefészek-tartalék általában gyenge volt.

A genetikai integritásról szóló törvény előkészítő munkája kimondta, hogy a PGS-t "egyértelműen meghatározott kutatási projektekre kell fenntartani egy etikai bizottság által jóváhagyott etikai felülvizsgálatban". Ezt a korlátozást azért vezették be, mert a PGS-rel kapcsolatos ismeretek akkoriban nagyon korlátozottak voltak. A PGS-sel kapcsolatos kutatási projektekből származó több tapasztalatot szükségesnek tartottak annak meghatározásához, hogy a PGS alkalmazható-e a klinikai gyakorlatban. A genetikai integritásról szóló törvény fent említett előkészítő munkája azt is kimondja, hogy a PGS "fontos eszközzé válhat a terhesség esélyének növelésében az IVF kezeléssel együtt...". Ebben a projektben azt kívánjuk megvizsgálni, hogy lehetséges-e növelni a terhesség és a szülés esélyét olyan párok körében, akik korábban több sikertelen IVF kísérleten estek át. Hipotézisünk azon a feltételezésen alapul, hogy gyakran a nem megfelelő számú kromoszóma a sikertelen beültetés vagy vetélés hátterében. A szüléshez vezető terhesség kialakulásának esélyének növelése érdekében kromoszómaelemzést végzünk a párok embrióin, hogy csak normális kromoszómakészlettel rendelkező embriók kerüljenek a nőbe.

Kérdés Növelheti-e a terhesség és a szülés valószínűségét olyan párok esetében, akiknél korábban több sikertelen IVF-kísérlet történt, ha az embrióban az átültetés előtt biztosítható a normál kromoszómakészlet? Kontrollként összehasonlítjuk azon IVF kísérletek eredményeit, ahol csak fénymikroszkópos értékelést végeznek.

Elsődleges végpont: Szülés randomizált betegenként Másodlagos végpontok: kumulatív terhességi arány, beleértve a megmaradt üvegesített blasztociszták későbbi átvitelét (magasabb arány várható a vizsgálati csoportban). A vetélések aránya a terhesség első 18 hetében (alacsonyabb arány várható a vizsgálati csoportban).

Módszerek és anyagok Betegek Azok a párok, akiknek a kórelőzményében legalább három sikertelen IVF-kísérlet szerepel, és a nő életkora legfeljebb 39 éves, az új IVF-kezelésre irányuló konzultációjuk alkalmával bármely IVF Sweden klinikán meghívást kapnak a részvételre. a vizsgálatban, feltéve, hogy megfelelnek a felvételi kritériumoknak (beleértve a 8-10 tojással történő hormonstimulációra adott várható normális választ). Azokat a nőket, akik vállalják, hogy részt vesznek a vizsgálatban, véletlenszerűen besorolják (számítógéppel) a biopsziába vagy a kontrollcsoportba a petesejtek begyűjtését követő napon, ha legalább 5 megtermékenyített petesejtjük van (a tenyésztés jelenlegi eljárása az 5. napon).

Bevételi kritériumok: Olyan párok, akik megfelelnek az IVF kezelés kritériumainak, és akiknek a kórtörténetében legalább három IVF ciklus szerepel, beleértve a szülés nélküli embriótranszfert. A nő legfeljebb 39 éves lehet a vizsgálat időpontjában, és normális-jó petefészek-tartalékkal (legalább 12 antrális tüszővel) kell rendelkeznie. Partnerének élő spermát tartalmazó spermamintát kell tudnia szolgáltatni. A vizsgálatba bevont nők semmilyen más kutatási projektben nem vesznek részt.

Kizárási kritériumok: Myoma vagy egyéb méhelváltozások, amelyekről úgy ítélték meg, hogy befolyásolják a beültetést. Nem specifikus ciszták, amelyek nem tekinthetők működőképesnek. Endometrium >3 cm.

Randomizálás

A véletlenszerű besorolásra az 1. napon kerül sor, ha a pár megfelel a blasztociszta stádiumig történő tenyésztésre vonatkozó követelményeknek (legalább 5 normálisan megtermékenyített petesejtek). Az on-line randomizációs program (számítógépes) a következő paramétereket egyensúlyozza ki:

• Kor
• A kinyert petesejtek száma

Ezenkívül a randomizáció idején a randomizációs program figyelembe veszi, hogy a torzítás elkerülése érdekében többközpontú vizsgálatot kell végezni.

IVF kezelés A hormonstimuláció, az ultrahangos vizsgálatok, a petesejtek gyűjtése és a megtermékenyítés a szokásos eljárást követi. A kontrollcsoportba tartozó nők esetében az összes kitágult blasztocisztát az 5-6. napon mélyhűtve (üvegesítve) tárolják a későbbi átvitel céljából. A PGS-be randomizált nőknél a sejteket (trofektoderma sejteket az embrió külső sejtrétegében) az 5-6. napon biopsziával veszik, majd az összes biopsziás blasztocisztát üvegesítik. Ha az elemzés normális kromoszómakészletet mutat, a blasztocisztát felengedik és áthelyezik a következő menstruációs ciklus során.

Biopszia és sejtlízis A biopszia úgy történik, hogy a blasztociszta (zona pellucida) héján lézeres technológiával és speciális biopsziás berendezéssel lyukat készítenek, és 2-5 sejtet eltávolítanak a külső sejttömegből (trofoblaszt sejtek). A sejteket PBS-oldatot tartalmazó kémcsőbe visszük át. Extrakciós oldatot adunk hozzá a sejtek líziséhez, és a DNS-t az oldatba engedjük.

A genom amplifikáció optimalizálása A sejtlízis és a teljes genom amplifikáció protokolljának optimalizálása érdekében 13-as triszómiával rendelkező embrionális őssejtvonalból, valamint normál kariotípusból származó sejteket használnak. Három, négy és öt sejtet pipettázunk PCR-csövekbe. A teljes aCGH protokollt (lásd alább) ezeken a sejteken futtatják (legalább 50 cső), és az eredményeket kiértékelik. Ez a megközelítés képet ad a módszer érzékenységéről és arról, hogy milyen gyakran nem sikerül eredményt elérni a sikertelen amplifikáció miatt. A rendszerben lévő szennyeződés, ha van, szintén kiderül.

Összehasonlító genomi hibridizációs (aCGH) reagenst adunk a DNS-kivonathoz a DNS amplifikálására (másolására). Az amplifikációt több lépésben hajtják végre a "polimeráz láncreakció" (PCR) technikával. Ez az eljárás nagy pontosságot és speciális laboratóriumi eszközöket igényel, hogy az idegen DNS ne szennyezze be a mintát. A szennyeződés ebben a lépésben az embriók kromoszómaszerkezetének téves diagnózisához vezethet. Az amplifikált DNS-t ezután egy fluoreszcens molekulával jelölik, amely UV megvilágítás mellett zölden fluoreszkálja a DNS-t. Hasonlóképpen, a normál kontroll DNS-t egy olyan molekulával jelölik, amely UV-fényben vörösen fluoreszkál. Az amplifikált fluoreszcensen jelölt DNS-t azonos térfogatú normál fluoreszcensen jelölt kontroll DNS-sel keverjük össze. Ezt a DNS-keveréket specifikus DNS-szekvenciákat tartalmazó tesztfelületekre visszük fel. Ezeket a DNS-szekvenciákat gondosan kiválasztják, és meghatározott sorrendben, hosszú tömbökben helyezik el a tesztfelületeken, ami azt jelenti, hogy az összes kromoszómakar DNS-e meghatározott helyeken megjelenik a tesztfelületen. A hibridizációs lépés során a DNS-keverékben lévő DNS verseng a tesztfelületen lévő DNS-hez való kötődésért. Ha azonos mennyiségű amplifikált DNS (zöld) és kontroll DNS (piros) van, akkor mindkét frakcióból azonos mennyiségű DNS kötődik a tesztfelülethez. A hibridizáció után, amikor a tesztfelületet UV fénnyel világítják meg, a zöld és a vörös fluoreszcencia egyformán intenzív lesz, ami narancssárga színt eredményez (egyenlő mennyiségű vörös és zöld szín keveréke). Ha azonban egy adott kromoszómából származó DNS feleslegben van az embrióban (pl. triszómia), akkor ebből a kromoszómából több DNS-szekvencia kötődik a tesztfelülethez, ami túlzott zöld fluoreszcenciát eredményez a vizsgálati felület azon a részén, amely tartalmaz a megfelelő kromoszómából származó DNS-szekvenciákat. Hasonlóképpen, egy kromoszóma elvesztése egy embrióban a megfelelő DNS hiányát eredményezi az amplifikált frakcióban, ami több kontroll DNS-szekvencia (piros) kötését okozza a tesztfelülethez. A tesztterületek szkennelése és az eredmények automatikus feldolgozása számítógépes szkennerben történik.

Az embriók osztályozása:

A blasztociszták értékelése és osztályozása a Gardner szerint elfogadott osztályozásnak megfelelően történik, amelyben a tágulás mértékét, a sejtsűrűséget és a sejtek számát a belső sejttömegben (IC) és a trofektodermában (TE) értékelik. A kontrollcsoportban lévő összes blasztocisztát üvegesítik a későbbi átvitelhez. Hasonló értékelést végeznek a biopsziás csoportban a biopszia előtt. A biopsziát követően minden biopsziás blasztociszta üveges lesz.

Abban a csoportban, amelyben a biopsziát végzik, microarray analízist végeznek. Az átvitel a természetes menstruációs ciklus során történik, 5 nappal az ovuláció után. A hormonális zavarban szenvedő nőknek enyhe hormonális stimulációra van szükségük az üvegesített/melegített blasztociszta átvitele előtt.

Vitrifikáció Miután a blasztocisztákat biopsziával vették, üvegessé teszik, majd felolvasztják a klinikákon jól bevált protokoll szerint.

Nyomon követés Az elsődleges végpont a véletlen besorolású betegenkénti születés. A másodlagos végpontok a kumulatív terhességi arány, mivel az extra mélyhűtött blasztociszták (ha vannak ilyenek) is átvitelre kerülnek, valamint a vetélések aránya a terhesség első 18 hetében (a vizsgálati csoportban alacsonyabb arány várható). Független külső szakértőkből álló Adatbiztonsági Ellenőrző Testület (DSMB) létrehozását tervezzük, ha a tanulmány fele elkészül.

Minden terhesség és szülés nyomon követése az IVF-en belüli jelenlegi eljárás szerint történik.

Statisztikai teljesítményelemzés kimutatta, hogy a terhesség kimenetelében a kontrollcsoport becsült 15%-a és a PGS csoport 40%-a közötti szignifikáns különbség kimutatásához 112 betegre van szükség (alfa=0,8; Béta=0,20). A körülbelül 10%-os becsült lemorzsolódási arány és a tervezett DSMB-elemzés azt jelenti, hogy 130 beteget kell toborozni. A DSMB figyelemmel kíséri a vizsgálatot, és időszakonként tanácsot ad arra vonatkozóan, hogy folytassuk-e a vizsgálatot. A DSMB elemzés 3 ajánlást ad: (1) folytassa a vizsgálatot a tervek szerint, (2) állítsa le a vizsgálatot, ha a csoportok közötti különbség kisebb, mint 15%, (3) folytassa a vizsgálatot nagyobb mintával. Ha a csoportok közötti különbség 20% ​​vagy nagyobb, a vizsgálat folytatható nagyobb mintaszámmal (73 beteg minden csoportban A DSMB elemzés a vizsgálat folytatását vagy leállítását javasolja (nagyon szignifikáns hatás, negatív hatás vagy alacsony feltételesség miatt). erő. A DSMB képes mind az élveszületést, mind a folyamatban lévő terhességet értékelni, és mérlegelni minden információt, amikor javaslatot tesz. A DSMB ezen a területen tapasztalt szakemberekből áll majd. A statisztikai számításokat a kezelési szándék (ITT) szerint, valamint protokollonként végzik el. Az ITT valamennyien randomizált betegek, akiknek az 1. napon legalább 5 megtermékenyített petesejtek vannak. Egyes betegek valószínűleg nem fognak átülni a blasztociszták hiánya vagy az üvegezéssel/melegítéssel kapcsolatos technikai problémák stb. miatt. Ezért az elemzés is protokollonként történik. A statisztikai számítások során logisztikus regressziót használunk, amely tartalmazza a rétegződési változókat.