PGS bruker mikroarray hos IVF-pasienter med gjentatt implantasjonssvikt

Bakgrunn In vitro fertilisering (IVF) er den viktigste metoden for å avhjelpe infertilitet, enten årsaken er hannen eller kvinnen, eller når årsaken er ukjent. Behandling innebærer vanligvis overføring til livmoren av et befruktet egg (embryo) som har vært dyrket i 2-5 dager. For å velge embryoet med best sjanse for vellykket implantasjon i endometriet, brukes mikroskopisk evaluering for tiden for å gradere embryonal celledeling, cellulært utseende og andre faktorer. Men denne metoden er ufullstendig fordi den ikke kan bestemme embryoets funksjonelle egenskaper, eller om det er genetisk normalt. Det er kjent at par med en historie med flere mislykkede IVF-behandlinger produserer et stort antall embryoer som har et unormalt antall kromosomer (aneuploidi), som også er vanlig hos kvinner over 38 år.

Dette prosjektet har til hensikt å bruke preimplantasjonsgenetisk screening (PGS) med mikroarrayteknikken for å bestemme kromosomsammensetningen til befruktede egg, slik at kun kromosomalt normale embryoer overføres under IVF. Hensikten er å øke sannsynligheten for graviditet og fødsel blant par med en historie med gjentatte mislykkede IVF-forsøk. Vi har tidligere utført en prospektiv randomisert studie med et lignende spørsmål (Ö 612-02) på en målgruppe av eldre kvinner (>38 år) ved bruk av prøvetaking (biopsi) av embryoet på dag 3 av kulturen, etterfulgt av analyse av syv kromosomer par som bruker FISH-teknikken. Resultatene av studien viste ingen forbedring i graviditetsresultatet. Årsakene er trolig 1) til å begynne med er normale egg sjelden i denne målgruppen; 2) biopsien ble utført på dag 3 når embryoet er på et sensitivt stadium; og 3) bare 7 av totalt 23 kromosompar kunne analyseres.

Metodeutviklingen på feltet har vært rask, og dagens teknologi gir mulighet for bedre identifikasjon av normale embryoer sammenlignet med forrige studie.

• Vi vet at embryoet er mindre følsomt når en biopsi utføres på dag 5 (av blastocyststadiet) i stedet for dag 3.
• Ved blastocystbiopsi fjernes flere celler for diagnose enn ved en dag 3 biopsi (og dermed øker påliteligheten til analysen).
• Blastocystbiopsi innebærer fjerning av færre celler på prosentbasis (3-5 %) fra blastocystens totale cellemasse sammenlignet med den tidligere brukte dag 3-biopsien, som innebar fjerning av opptil 25 % av det totale antallet celler.
• Blastocyster har høyere implantasjonshastighet enn embryoer på dag 3.
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) kan nå brukes med stor presisjon for å analysere alle kromosomer ved bruk av kommersielle kvalitetskontrollerte sett.
• Kryokonservering med forglasning av blastocyster er for tiden en svært vellykket teknikk som gjør at analysen kan utføres uten tidspress.

I tillegg vil vi henvende oss til en pasientgruppe bestående av kvinner med en påvist normal-god eggstokkreserve. I den forrige studien som involverte kvinner >38 år, var ovariereserven generelt dårlig.

I forarbeidene til lov om genetisk integritet het det at PGS skulle «forbeholdes klart definerte forskningsprosjekter godkjent i en etisk vurdering av en etisk komité». Denne begrensningen ble pålagt fordi kunnskapsstatusen om PGS på det tidspunktet var svært begrenset. Mer erfaring fra forskningsprosjekter på PGS ble ansett som nødvendig for å avgjøre om PGS kunne brukes i klinisk praksis. Ovennevnte forarbeid til genetisk integritetsloven sier også at PGS "kan bli et viktig verktøy for å øke sjansene for graviditet i forbindelse med IVF-behandling ...". I dette prosjektet har vi tenkt å undersøke om det er mulig å øke sjansen for graviditet og fødsel blant par som har gjennomgått flere tidligere mislykkede IVF-forsøk. Vår hypotese er basert på antakelsen om at feil antall kromosomer ofte er den underliggende årsaken til mislykket implantasjon eller spontanabort. For å øke sjansene for å etablere en graviditet som fører til fødsel, gjennomfører vi en kromosomanalyse på embryoene til par for å sikre at kun embryoer med normalt kromosomsett overføres til kvinnen.

Spørsmål Kan sannsynligheten for graviditet og fødsel hos par med flere tidligere mislykkede IVF-forsøk øke dersom man kan sikre et normalt kromosomsett i embryoet før det overføres? Som kontroll vil vi sammenligne resultatene av IVF-forsøk hvor det kun utføres lysmikroskopisk evaluering.

Primært endepunkt: Levering per randomisert pasient Sekundære endepunkter: Kumulativ graviditetsrate inkludert senere overføring av gjenværende vitrifiserte blastocyster (høyere rate forventet i studiegruppen). Abortrate i løpet av de første 18 ukene av svangerskapet (lavere rate forventet i studiegruppen).

Metoder og materialer Pasienter Par med en historie på minst tre mislykkede IVF-forsøk, hvor kvinnen er maksimalt 39 år gammel, vil bli invitert i forbindelse med konsultasjonen for en ny IVF-behandling ved en av IVF Sverige-klinikkene for å delta i studien, forutsatt at de oppfyller inklusjonskriteriene (inkludert forventet normal respons på hormonstimulering med 8-10 egg). Kvinnene som takker ja til å delta i studien vil bli randomisert (ved hjelp av datamaskin) til enten biopsien eller kontrollgruppen dagen etter innsamling av oocytter dersom de har minst 5 befruktede egg (gjeldende prosedyre for dyrking på dag 5).

Inklusjonskriterier: Par som oppfyller kriteriene for IVF-behandling og som har en historie med minst tre tidligere IVF-sykluser inkludert embryooverføring uten fødsel. Kvinnen kan maksimalt være 39 år når studien gjennomføres og må ha en normal-god eggstokkreserve (minst 12 antralfollikler). Partneren hennes må kunne gi en sædprøve som inneholder levende sæd. Kvinner inkludert i studien vil ikke delta i noe annet forskningsprosjekt.

Eksklusjonskriterier: Myom eller andre livmorlesjoner som vurderes å påvirke implantasjonen. Uspesifikke cyster som ikke anses å være funksjonelle. Endometrium >3 cm.

Randomisering

Randomisering vil skje på dag 1 dersom paret oppfyller kravene fastsatt for dyrking til blastocyststadiet (minst 5 normalt befruktede oocytter). Det elektroniske randomiseringsprogrammet (datastyrt) vil balansere følgende parametere:

• Alder
• Antall oocytter hentet

Videre vil randomiseringsprogrammet ved randomisering ta hensyn til at en multisenterstudie er involvert for å unngå skjevhet.

IVF-behandling Hormonstimulering, ultralydkontroll, oppsamling av oocytter og befruktning vil følge standard prosedyre. For kvinner i kontrollgruppen vil alle utvidede blastocyster kryokonserveres (vitrifisert) dag 5-6 for senere overføring. For kvinner randomisert til PGS vil celler (trofektodermceller i ytre cellelag av embryoet) bli biopsiert på dag 5-6, hvoretter alle biopsierte blastocyster vil bli forglasset. Hvis analysen viser et normalt kromosomsett, vil blastocysten tines og overføres i løpet av neste menstruasjonssyklus.

Biopsi og cellelyse Biopsien utføres ved å lage et hull i skallet til blastocysten (zona pellucida) ved hjelp av laserteknologi og spesialbiopsiutstyr og fjerne 2-5 celler fra den ytre cellemassen (trofoblastceller). Cellene overføres til et reagensrør som inneholder PBS-løsning. En ekstraksjonsløsning tilsettes for å lysere cellene, og DNA frigjøres i løsningen.

Optimalisering av genomamplifikasjon For å optimalisere protokollen for cellelyse og helgenomamplifisering, vil det brukes celler fra en embryonal stamcellelinje med trisomi 13 samt fra en normal karyotype. Tre, fire og fem celler vil bli pipettert til PCR-rør. Hele aCGH-protokollen (se nedenfor) vil bli kjørt på disse cellene (minst 50 rør), og resultatene vil bli evaluert. Denne tilnærmingen vil gi oss en ide om metodens følsomhet og hvor ofte vi ikke klarer å oppnå resultater på grunn av mislykket amplifikasjon. Eventuell forurensning i systemet vil også bli avdekket.

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Reagens for amplifikasjon (kopiering) av DNA tilsettes til DNA-ekstraktet. Amplifikasjon utføres i flere trinn ved bruk av en teknikk kalt "Polymerase Chain Reaction" (PCR). Denne prosessen krever stor nøyaktighet og spesielle laboratoriefasiliteter slik at fremmed DNA ikke forurenser prøven. Kontaminering på dette trinnet kan føre til en feildiagnose av kromosomkonstitusjonen til embryoene. Det amplifiserte DNA blir deretter merket med et fluorescerende molekyl som får DNA til å fluorescere grønt under UV-belysning. På samme måte er normalt kontroll-DNA merket med et molekyl som fluorescerer rødt under UV-belysning. Amplifisert fluorescerende merket DNA blandes med et likt volum av normalt fluorescerende merket kontroll-DNA. Denne DNA-blandingen påføres testoverflater med spesifikke DNA-sekvenser. Disse DNA-sekvensene er nøye utvalgt og plassert på testflatene i lange arrays i en bestemt rekkefølge, noe som betyr at DNA fra alle kromosomarmene er representert på testflaten på bestemte steder. Under hybridiseringstrinnet vil DNA i DNA-blandingen konkurrere om binding til DNA på testoverflaten. Hvis det er like mengder amplifisert DNA (grønt) og kontroll-DNA (rødt), vil like mye DNA fra begge fraksjoner binde seg til testoverflaten. Etter hybridisering, når testoverflaten er opplyst med UV-lys, vil den grønne og røde fluorescensen være like intens, noe som resulterer i en oransje farge (blanding med like deler av rød og grønn farge). Men hvis det er et overskudd av DNA fra et gitt kromosom i embryoet (f.eks. trisomi), vil flere DNA-sekvenser fra dette kromosomet binde seg til testoverflaten, noe som resulterer i et overskudd av grønn fluorescens i området på testoverflaten som inneholder DNA-sekvensene fra det aktuelle kromosomet. På samme måte resulterer tap av et kromosom i et embryo i mangel på tilsvarende DNA i den amplifiserte fraksjonen, noe som fører til at flere kontroll-DNA-sekvenser (røde) binder seg til testoverflaten. Testområder skannes og resultatene behandles automatisk i en datastyrt skanner.

Gradering av embryoer:

Evaluering og gradering av blastocystene vil bli gjort i henhold til akseptert klassifisering i henhold til Gardner hvor ekspansjonsgrad, celletetthet, og antall celler i indre cellemasse (IC) og i trophectoderm (TE) vurderes. Alle blastocyster i kontrollgruppen vil bli forglasset for senere overføring. En lignende evaluering vil bli utført i biopsigruppen før biopsi. Etter biopsi vil alle biopsierte blastocyster bli forglasset.

I gruppen der biopsien utføres, vil det bli utført mikroarray-analyse. Overføring gjøres under den naturlige menstruasjonssyklusen 5 dager etter eggløsning. Kvinner med hormonelle forstyrrelser krever mild hormonell stimulering før overføring av den forglassede/oppvarmede blastocysten.

Forglasning Etter at blastocystene er biopsiert, vil de bli forglasset og deretter tint i henhold til godt etablert protokoll ved klinikkene.

Oppfølging Det primære endepunktet er fødsel per randomisert pasient. Sekundære endepunkter er kumulativ graviditetsrate, siden ekstra kryokonserverte blastocyster (hvis noen) også overføres, og spontanabortrate i løpet av de første 18 ukene av svangerskapet (lavere rate forventet i studiegruppen). Vi planlegger å opprette et Data Safety Monitoring Board (DSMB) bestående av uavhengige eksterne eksperter når halve studien er fullført.

Oppfølging av alle svangerskap og fødsler vil bli utført etter gjeldende prosedyre innen IVF.

Statistikk Power-analyse har vist at det kreves 112 pasienter for å oppdage en signifikant forskjell i graviditetsutfall fra estimerte 15 % i kontrollgruppen til 40 % i PGS-gruppen (alfa=0,8; Beta=0,20). En estimert utmattelsesrate på ca. 10 % og den planlagte DSMB-analysen betyr at 130 pasienter bør rekrutteres. DSMB vil overvåke studien og gi periodiske råd om hvorvidt vi bør fortsette studien. DSMB-analysen vil gi 3 anbefalinger: (1) fortsett studien som planlagt, (2) stopp studien hvis forskjellen mellom gruppene er mindre enn 15 %, (3) fortsett studien med en større utvalgsstørrelse. Når forskjellen mellom gruppene er 20 % eller større kan studien fortsettes med en større utvalgsstørrelse (73 pasienter i hver gruppe DSMB-analysen vil anbefale å fortsette eller stoppe studien (på grunn av svært signifikant effekt, negativ effekt eller lav betinget effekt). makt. DSMB kan vurdere både levendefødte og pågående graviditet og veie all informasjon når de gir anbefalingen. DSMB vil bestå av spesialister som har erfaring på dette feltet. Statistiske beregninger vil bli utført i henhold til intention-to-treat (ITT), samt per protokoll. ITT er alle randomiserte pasienter som har minst 5 befruktede oocytter på dag 1. Noen pasienter vil sannsynligvis ikke ha noen overføring på grunn av mangel på blastocyster, eller tekniske problemer knyttet til forglasning/oppvarming etc. Derfor vil det også bli gjort analyser per protokoll. Logistisk regresjon vil bli brukt i de statistiske beregningene og inkluderer stratifiseringsvariablene.