多発性硬化症における腸内細菌叢の役割を解読する

方法と運用計画の説明

私たちの研究計画は次のステップで構成されています。

1. コホートの集合体。 上記のそれぞれの目的のために、研究者はシバ医療センターの独自のデータベースを使用して関連する個人を特定し、研究に参加するよう招待します。 アキロン教授は、センターが利用できる独自の患者データベースを活用した多くの研究プロジェクトを実施した豊富な経験を持っています。 MS患者と健康な個人を比較する最初の目的では、研究者は性別、年齢、食事が一致する健康な個人を選択します。同じ環境に住んでいる個人はより類似した微生物叢を持っているため、理想的にはMS患者の配偶者を健康な対照として選択します。 診断からの期間が類似しているが重症度が異なる MS 患者を比較する 2 番目の目的では、研究者らは、センターが採用する EDSS スコアによって判断される疾患の重症度の可能な限り広い範囲にわたる MS 患者を選択します。 最終的な目的のために、再発のリスクが高い人は 6 か月ごとにプロファイリングを依頼され、再発が発生した場合は、センター訪問時と再発イベントの 1 か月後にプロファイリングが行われます。
2. コホートプロファイリング。 各患者から、研究者は、必要に応じて以下のサブセットから構成される多次元データを MS データベースから取得します。(1) 以下を含む臨床メタデータ。薬;年間再発率。 (2) 全血球計算、完全な生化学、脂質プロファイル、コレステロールプロファイルを含む血液検査。 (3) EDSS スコア、認知評価、歩行評価を取得するための完全な神経学的検査。 MRI 画像データ、誘発電位、治療反応。 (4) 血液サンプルはタンパク質 mRNA 発現のために処理され、末梢血単核球 (PBMC) が Ficoll-Hypaque 勾配で分離され、全 RNA が精製され、標識され、Genechip アレイ (U133A2) にハイブリダイズされ、スキャンされます (GeneArray-TM スキャナー) Ｇ２５００Ａ；Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）、製造業者のプロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）に従って。 MAS5 ソフトウェア (Affymetrix) を使用して、十分に注釈が付けられた 14,500 個のヒト遺伝子に対応する約 22,000 個の遺伝子転写物を含むスキャンされたアレイを分析します。 (5) 便サンプルから得られた腸内微生物叢プロファイルは、ショットガン メタゲノム シーケンスおよび 16S rRNA プロファイリングのために処理されます。 腸内微生物叢のプロファイリングは便サンプルから行われ、液体窒素中で即座に急速冷凍され、さらに処理されるまで最低 -80°C で保存されます。 その後、サンプルはワイツマンのシーガル研究所で開発された自動ロボットパイプラインによって処理されます。 このパイプラインは 96 ウェル形式で動作し、1 日以内に 96 個の便サンプルから DNA を抽出し、別の日でショットガンメタゲノムシークエンシング用の DNA イルミナライブラリを準備し、別の日で 16S rRNA 遺伝子の多重ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅を実行できます。日。 したがって、収集されたすべての 96 便サンプル グループは、1 人の検査技師の監督の下、3 日以内に 16S とメタゲノム シーケンスの両方のためにロボット処理できます。
3. データ分析とアルゴリズム開発。 (I) 微生物叢: MS における微生物叢の役割を包括的に研究するために、研究者らは標準的な 16S rRNA 分析をはるかに超えて、完全なショットガン メタゲノム サンプルの分析に取り組みます。 メタゲノムシーケンスは、便サンプルの DNA 内容全体をシーケンスすることで、ゲノム構造、構造変異体、遺伝子および代謝経路の機能を研究できるため、16S と比較してより多くの情報を提供できる可能性があります。 マイクロバイオームからこれらの特徴を抽出した後(下記の暫定結果を参照)、研究者らは基本的な単変量および多変量関連テストの採用から開始し、マイクロバイオームの特徴に基づいてMS患者と非MS患者を区別しようとするより複雑な機械学習モデルを継続します。 (目的 1)、疾患の重症度を分類する (目的 2)、再発リスクを予測する (目的 3)、MS 疾患の表現型、つまり放射線医学的に孤立した症候群 (RIS)、臨床的に孤立した症候群 (CIS)、再発寛解型 MS を区別する (目的 3)。 RRMS）、原発進行性 MS（PPMS）（目的 4）、および治療反応者を特定する（目的 5）。 (II) 血液: タンパク質発現を分析するため Partek Genomics ソフトウェア (www.partek.com) 使用されます。
4. 単変量解析と多変量解析。 研究者らはまず、プロファイリングされたすべての個人から抽出されたすべてのマイクロバイオームの特徴とさまざまな患者の測定値（EDSSスコア、再発までの時間など）の間の相関関係（ピアソンとスピアマン）を計算し、実行された複数の仮説を修正します。 研究者は膨大な数のマイクロバイオームの特徴を生成し、それらの多くは相互に高度に相関しているため、特に参加者の数が特徴の数よりはるかに少ないことを考慮すると、この分析は統計的検出力の欠如に悩まされる可能性があります。 このため、研究者は多変量解析 (特異値分解、主成分分析など) も実行します。これらの方法で特定された主要な成分は、内部構造とデータ間の関係を考慮した方法でデータの主な変動を捕捉するためです。さまざまな入力機能。 その後、研究者らは、この分析における主要な主成分のいずれかによるデータの予測が、測定された代謝パラメーターによって参加者の有意な分離を提供するかどうかをテストします。 別の種類の多変量解析として、研究者らは、さまざまな教師なしクラスタリング手法 (階層的クラスタリング、ナイーブ ベイズなど) を使用してマイクロバイオームの特徴データによって参加者をクラスタリングし、その後、正常または異常な代謝パラメーターが豊富であるかどうかクラスターを検査します。

機械学習アルゴリズム。 MS に対するマイクロバイオームの全体的な寄与を定量化し、さまざまなマイクロバイオームの特徴の相対的な寄与を解明することを目的とした、より包括的なアプローチとして、研究者は、研究参加者を各目的でいくつかのグループに分類します (たとえば、目的 1 の患者と健常者)。目標は、MS 診断からの同様の期間で高い EDSS スコアと低い EDSS スコアを持つ 2 人の個人）、マイクロバイオームの特徴のみを使用して、この分類問題に対するさまざまな計算手法（ブーストされたデシジョン ツリー、サポート ベクター マシン アルゴリズム（SVM）など）を開発することです。上記で生成されました。 研究者は相互検証スキームを使用します。これにより、モデルのトレーニングはランダムに選択された参加者のサブセットのデータで行われ、その後、残りの参加者のデータでテストされます。 さらに、研究者は、相互検証で導出された最終モデルを評価するためのテスト セットを残しておき、モデルのパフォーマンスを正確に推定できるようにします。 マイクロバイオームの特徴の数、したがって次元の数が大きいため、研究者は過剰適合を回避し、次元を削減する手段としてさまざまな特徴選択アプローチを採用します。 Segal 研究室 (Weizmann) は、遺伝子制御の分野で同様の環境でいくつかのそのような方法の開発を先駆的に行ってきました。 研究者らは同様のスキームを使用して、MS 重症度を表す連続 EDSS スコアを予測する予定です。 問題の設定は分類と似ていますが、分類方法が回帰タイプの方法 (線形回帰、確率モデル、確率的勾配降下など) に置き換えられるため、方法の開発はまったく異なります。