Entschlüsselung der Rolle der Darmmikrobiota bei Multipler Sklerose

Beschreibung der Methoden und Operationsplan

Unser Forschungsplan besteht aus folgenden Schritten:

1. Kohortenversammlung. Für jedes der oben genannten Ziele nutzen die Forscher die einzigartige Datenbank des Sheba Medical Center, um die relevanten Personen zu identifizieren und sie zur Teilnahme an der Studie einzuladen. Prof. Achiron verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Durchführung zahlreicher Forschungsprojekte, die die einzigartige Patientendatenbank nutzen, die dem Zentrum zur Verfügung steht. Für das erste Ziel, MS-Patienten mit gesunden Personen zu vergleichen, werden die Forscher gesunde Personen auswählen, die nach Geschlecht, Alter und Ernährung übereinstimmen. Idealerweise wählen sie Ehepartner von MS-Patienten als gesunde Kontrollpersonen aus, da Personen, die in derselben Umgebung leben, ähnlichere Mikrobiota haben. In unserem zweiten Ziel vergleichen wir MS-Patienten mit ähnlicher Zeit ab der Diagnose, aber unterschiedlicher Schwere der Erkrankung. Die Forscher werden MS-Patienten auswählen, die das größtmögliche Spektrum an Schweregrad der Erkrankung abdecken, gemessen anhand des vom Zentrum verwendeten EDSS-Scores. Um das Endziel zu erreichen, werden Personen mit hohem Rückfallrisiko alle 6 Monate zur Profilerstellung eingeladen. Tritt ein Rückfall auf, wird bei ihrem Besuch im Zentrum sowie einen Monat nach dem Rückfall ein Profil erstellt.
2. Kohortenprofilierung. Von jedem Patienten erhalten die Forscher mehrdimensionale Daten aus der MS-Datenbank, die gegebenenfalls aus einer Teilmenge von: (1) klinischen Metadaten, einschließlich: Einverständnisformular; Medikamente; jährliche Rückfallrate; (2) Blutuntersuchungen, einschließlich eines vollständigen Blutbildes, einer vollständigen Biochemie, eines Lipidprofils und eines Cholesterinprofils; (3) Komplette neurologische Untersuchung zur Erlangung eines EDSS-Scores, kognitive Beurteilung, Gangbeurteilung; MRT-Bilddaten, evozierte Potenziale, Ansprechen auf die Behandlung; (4) Blutproben werden zur Protein-mRNA-Expression verarbeitet und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten getrennt, die Gesamt-RNA gereinigt, markiert, mit dem Genechip-Array (U133A2) hybridisiert und gescannt (GeneArray-TM-Scanner). G2500A; Hewlett Packard) gemäß dem Protokoll des Herstellers (Affymetrix, Santa Clara, CA). Mithilfe der MAS5-Software (Affymetrix) werden die gescannten Arrays analysiert, die etwa 22.000 Gentranskripte enthalten, die 14.500 gut annotierten menschlichen Genen entsprechen. (5) Das aus Stuhlproben gewonnene Darmmikrobiota-Profil wird für die Shotgun-Metagenomsequenzierung und die 16S-rRNA-Profilierung verarbeitet. Die Profilierung der Darmmikrobiota erfolgt anhand von Stuhlproben, die sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei mindestens -80 °C aufbewahrt werden. Die Proben werden dann von einer automatisierten Roboterpipeline verarbeitet, die im Segal-Labor bei Weizmann entwickelt wurde. Diese Pipeline arbeitet im 96-Well-Format und kann an einem Tag DNA aus 96 Stuhlproben extrahieren, an einem anderen Tag DNA-Illumina-Bibliotheken für die metagenomische Shotgun-Sequenzierung vorbereiten und an einem anderen Tag eine Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens durchführen Tag. Somit kann jede gesammelte 96-Stuhl-Probengruppe innerhalb von 3 Tagen unter der Aufsicht eines Labortechnikers robotergesteuert sowohl für die 16S- als auch für die metagenomische Sequenzierung verarbeitet werden.
3. Datenanalyse und algorithmische Entwicklung. (I) Mikrobiota: Um die Rolle des Mikrobioms bei MS umfassend zu untersuchen, werden die Forscher weit über die standardmäßige 16S-rRNA-Analyse hinausgehen und sich mit der Analyse vollständiger Shotgun-Metagenomproben befassen. Durch die Sequenzierung des gesamten DNA-Gehalts von Stuhlproben kann die Metagenomsequenzierung im Vergleich zur 16S-Sequenzierung möglicherweise viel mehr Informationen liefern, da sie die Untersuchung der Genomstruktur, struktureller Varianten sowie der Funktionen von Genen und Stoffwechselwegen ermöglicht. Nach der Extraktion dieser Merkmale aus dem Mikrobiom (siehe unten in den vorläufigen Ergebnissen) werden die Forscher zunächst grundlegende univariate und multivariate Assoziationstests anwenden und dann mit komplexeren Modellen des maschinellen Lernens fortfahren, die versuchen, Personen mit MS von denen ohne MS anhand von Mikrobiommerkmalen zu unterscheiden (Ziel 1), die Schwere der Erkrankung zu klassifizieren (Ziel 2), das Rückfallrisiko vorherzusagen (Ziel 3), zwischen MS-Krankheitsphänotypen zu unterscheiden, d. h. radiologisch isoliertem Syndrom (RIS), klinisch isoliertem Syndrom (CIS), schubförmig remittierender MS ( RRMS), primär-progressive MS (PPMS) (Ziel 4) und Identifizierung von Therapieansprechenden (Ziel 5). (II) Blut: Zur Analyse der Proteinexpression Partek Genomics Software (www.partek.com) verwendet wird.
4. Univariate und multivariate Analysen. Die Forscher berechnen zunächst die Korrelation (Pearson und Spearman) zwischen allen Mikrobiommerkmalen, die bei allen profilierten Personen extrahiert wurden, und den verschiedenen Patientenmessungen (EDSS-Score, Zeit seit dem Rückfall usw.) und korrigieren die mehreren aufgestellten Hypothesen. Da die Forscher eine große Anzahl von Mikrobiommerkmalen generieren werden und viele von ihnen stark miteinander korrelieren, könnte diese Analyse unter mangelnder statistischer Aussagekraft leiden, insbesondere angesichts der Tatsache, dass die Anzahl der Teilnehmer weitaus geringer sein wird als die Anzahl der Merkmale. Aus diesem Grund werden die Forscher auch multivariate Analysen durchführen (z. B. Singularwertzerlegung, Hauptkomponentenanalyse), da die mit diesen Methoden identifizierten Schlüsselkomponenten die Hauptvariation in den Daten auf eine Weise erfassen, die die interne Struktur und die Beziehungen zwischen ihnen berücksichtigt die verschiedenen Eingabefunktionen. Die Forscher werden dann testen, ob Projektionen der Daten durch einen der Hauptbestandteile dieser Analyse eine signifikante Trennung der Teilnehmer nach ihren gemessenen Stoffwechselparametern ermöglichen. Als eine andere Art der multivariaten Analyse werden die Forscher auch verschiedene unbeaufsichtigte Clustering-Methoden (z. B. hierarchisches Clustering, naive Bayes) einsetzen, um die Teilnehmer anhand ihrer Mikrobiom-Merkmalsdaten zu gruppieren, und dann die Cluster auf Anreicherung normaler oder abnormaler Stoffwechselparameter untersuchen.

Algorithmen für maschinelles Lernen. Als globalerer Ansatz, der darauf abzielt, den Gesamtbeitrag des Mikrobioms zur MS zu quantifizieren und den relativen Beitrag der verschiedenen Mikrobiommerkmale aufzudecken, werden die Forscher die Studienteilnehmer für jedes Ziel in mehrere Gruppen einteilen (z. B. Ziel-1-Patienten versus Gesunde). Individuen; im Ziel 2 Individuen mit hohem versus niedrigem EDSS-Score für den gleichen Zeitraum seit der MS-Diagnose) und verschiedene Berechnungsmethoden (z. B. verstärkte Entscheidungsbäume, Support Vector Machine-Algorithmen (SVMs)) für dieses Klassifizierungsproblem entwickeln, wobei nur die Mikrobiommerkmale verwendet werden oben generiert. Die Forscher werden ein Kreuzvalidierungsschema verwenden, bei dem das Modelltraining anhand der Daten einer zufällig ausgewählten Teilmenge von Teilnehmern durchgeführt und dann anhand der Daten der verbleibenden Teilnehmer getestet wird. Darüber hinaus werden die Forscher einen Testsatz beiseite lassen, anhand dessen die Forscher das endgültige Modell bewerten, das in der Kreuzvalidierung abgeleitet wird, was eine echte Schätzung der Leistung unserer Modelle ermöglicht. Da die Anzahl der Mikrobiommerkmale und damit die Anzahl der Dimensionen groß ist, werden die Forscher verschiedene Ansätze zur Merkmalsauswahl anwenden, um eine Überanpassung zu vermeiden und die Dimensionalität zu reduzieren. Das Segal-Labor (Weizmann) hat bei der Entwicklung mehrerer solcher Methoden in ähnlichen Umgebungen im Bereich der Genregulation Pionierarbeit geleistet. Die Forscher werden auch ein ähnliches Schema verwenden, um den kontinuierlichen EDSS-Score vorherzusagen, der den MS-Schweregrad darstellt. Der Problemaufbau ähnelt der Klassifizierung, die Methodenentwicklung unterscheidet sich jedoch deutlich, da die Klassifizierungsmethoden durch Regressionsmethoden ersetzt werden (z. B. lineare Regression, probabilistische Modelle, stochastischer Gradientenabstieg).