De rol van de darmmicrobiota bij multiple sclerose ontcijferen

Beschrijving van methoden en werkplan

Ons onderzoeksplan bestaat uit de volgende stappen:

1. Cohort vergadering. Voor elk van de bovengenoemde doelen zullen de onderzoekers de unieke database van het Sheba Medical Center gebruiken om de relevante personen te identificeren en hen uit te nodigen om deel te nemen aan het onderzoek. Prof. Achiron heeft veel ervaring met het uitvoeren van veel onderzoeksprojecten waarbij gebruik wordt gemaakt van de unieke patiëntendatabase waarover het Centrum beschikt. Voor het eerste doel, het vergelijken van MS-patiënten met gezonde individuen, zullen de onderzoekers gezonde individuen selecteren op basis van geslacht, leeftijd en dieet, en idealiter de echtgenoten van MS-patiënten selecteren als gezonde controles, aangezien individuen die in dezelfde omgeving leven meer vergelijkbare microbiota hebben. In ons tweede doel, het vergelijken van MS-patiënten met een vergelijkbare tijd vanaf de diagnose maar met een verschillende ernst van de ziekte, zullen de onderzoekers MS-patiënten selecteren die het grootst mogelijke spectrum van ziekte-ernst omvatten, beoordeeld aan de hand van de EDSS-score die door het Centrum wordt gebruikt. Voor het uiteindelijke doel zullen personen met een hoog risico op terugval om de 6 maanden worden uitgenodigd voor profilering en als er een terugval optreedt, zullen ze worden geprofileerd tijdens hun bezoek aan het Centrum en een maand na de terugval.
2. Cohortprofilering. Van elke patiënt zullen de onderzoekers multidimensionale gegevens verkrijgen uit de MS-database, waar van toepassing, bestaande uit een subset van: (1) Klinische metagegevens, waaronder: Toestemmingsformulier; medicijnen; jaarlijks terugvalpercentage; (2) Bloedonderzoek, inclusief een volledig bloedbeeld, volledige biochemie, lipidenprofiel, cholesterolprofiel; (3) Volledig neurologisch onderzoek voor het verkrijgen van een EDSS-score, cognitieve beoordeling, gangbeoordeling; MRI-beeldgegevens, evoked potentials, respons op behandeling; (4) Bloedmonsters zullen worden verwerkt voor eiwit-mRNA-expressie en perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) zullen worden gescheiden op Ficoll-Hypaque-gradiënt, totaal RNA gezuiverd, gelabeld, gehybridiseerd met Genechip-array (U133A2) en gescand (GeneArray-TM-scanner G2500A; Hewlett Packard) volgens het protocol van de fabrikant (Affymetrix, Santa Clara, CA). MAS5-software (Affymetrix) zal worden gebruikt om de gescande arrays te analyseren die ~ 22.000 gentranscripten bevatten die overeenkomen met 14.500 goed geannoteerde menselijke genen. (5) Darmmicrobiota-profiel verkregen uit ontlastingsmonsters zal worden verwerkt voor shotgun-metagenomische sequencing en 16S rRNA-profilering. De darmmicrobiota wordt geprofileerd op basis van ontlastingsmonsters die onmiddellijk snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij minimaal -80°C tot verdere verwerking. Monsters worden vervolgens verwerkt door een geautomatiseerde robotpijplijn die is ontwikkeld in het Segal-lab in Weizmann. Deze pijplijn werkt in een formaat met 96 putjes en kan binnen één dag DNA extraheren uit 96 ontlastingsmonsters, binnen een dag DNA Illumina-bibliotheken voorbereiden voor shotgun metagenomische sequencing en multiplexed polymerase chain reaction (PCR) amplificatie van het 16S rRNA-gen uitvoeren in een andere dag. Zo kan elke verzamelde monstergroep met 96 ontlasting binnen 3 dagen robotachtig worden verwerkt voor zowel 16S- als metagenomische sequencing onder toezicht van één laboratoriumtechnicus.
3. Data-analyse en algoritmische ontwikkeling. (I) Microbiota: om de rol van het microbioom bij MS uitgebreid te bestuderen, zullen de onderzoekers veel verder gaan dan de standaard 16S rRNA-analyse en in analyse van volledige shotgun-metagenoommonsters. Door het volledige DNA-gehalte van ontlastingsmonsters te sequensen, kan metagenoomsequencing mogelijk veel meer informatie opleveren in vergelijking met 16S, omdat het de genoomstructuur, structurele varianten en gen- en metabolische routefuncties kan bestuderen. Na het extraheren van deze kenmerken uit het microbioom (zie hieronder in Voorlopige resultaten), zullen de onderzoekers beginnen met het gebruik van elementaire univariate en multivariate associatietests, en doorgaan met complexere machine learning-modellen die proberen individuen met MS te onderscheiden van mensen zonder op basis van microbioomkenmerken (doel 1), om de ernst van de ziekte te classificeren (doel 2), om het terugvalrisico te voorspellen (doel 3), om onderscheid te maken tussen MS-ziektefenotypes, d.w.z. radiologisch geïsoleerd syndroom (RIS), klinisch geïsoleerd syndroom (CIS), relapsing-remitting MS ( RRMS), primair-progressieve MS (PPMS), (doel 4) en het identificeren van patiënten die reageren op de behandeling (doel 5). (II) Bloed: om eiwitexpressie te analyseren Partek Genomics Software (www.partek.com) zal gebruikt worden.
4. Univariate en multivariate analyses. De onderzoekers zullen eerst de correlatie (Pearson en Spearman) berekenen tussen alle microbioomkenmerken die zijn geëxtraheerd over alle geprofileerde individuen en de verschillende patiëntmetingen (EDSS-score, tijd vanaf terugval, enz.), en corrigeren voor de meerdere uitgevoerde hypothesen. Aangezien de onderzoekers een groot aantal microbioomkenmerken zullen genereren en veel ervan sterk met elkaar gecorreleerd zijn, kan deze analyse te kampen hebben met een gebrek aan statistische kracht, vooral gezien het feit dat het aantal deelnemers veel kleiner zal zijn dan het aantal kenmerken. Om deze reden zullen de onderzoekers ook multivariate analyses uitvoeren (bijv. ontleding van singuliere waarden, analyse van hoofdcomponenten), aangezien de sleutelcomponenten die door deze methoden worden geïdentificeerd, de belangrijkste variatie in de gegevens vastleggen op een manier die rekening houdt met de interne structuur en relaties tussen de verschillende invoerfuncties. De onderzoekers zullen vervolgens testen of projecties van de gegevens door een van de belangrijkste hoofdcomponenten in deze analyse een significante segregatie van de deelnemers opleveren op basis van hun gemeten metabolische parameters. Als een ander type multivariate analyse zullen de onderzoekers ook verschillende niet-gecontroleerde clusteringmethoden gebruiken (bijv. Hiërarchische clustering, naïeve Bayes) om de deelnemers te clusteren op basis van hun microbioomkenmerken, en vervolgens de clusters te onderzoeken op verrijking in normale of abnormale metabolische parameters.

Algoritmen voor machinaal leren. Als een meer globale benadering gericht op het kwantificeren van de algehele bijdrage van het microbioom aan MS en het ontrafelen van de relatieve bijdrage van de verschillende microbioomkenmerken, zullen de onderzoekers de studiedeelnemers in verschillende groepen indelen voor elk doel (bijv. in doel 1 patiënten versus gezonde individuen; in doel 2 individuen met hoge versus lage EDSS-score voor dezelfde tijd vanaf MS-diagnose), en verschillende rekenmethoden ontwikkelen (bijv. versterkte beslissingsbomen, Support Vector Machine-algoritmen (SVM's)) voor dit classificatieprobleem met alleen de microbioomkenmerken hierboven gegenereerd. De onderzoekers zullen een kruisvalidatieschema gebruiken, waarbij de modeltraining wordt gedaan op de gegevens van een willekeurig gekozen subgroep van deelnemers en vervolgens wordt getest op de gegevens van de resterende deelnemers. Bovendien laten de onderzoekers een testset achter waarop de onderzoekers het definitieve model evalueren dat is afgeleid in kruisvalidatie, waardoor een juiste schatting van de prestaties van onze modellen mogelijk is. Aangezien het aantal kenmerken van het microbioom en dus het aantal dimensies groot is, zullen de onderzoekers verschillende benaderingen voor kenmerkselectie gebruiken om overfitting te voorkomen en dimensionaliteit te verminderen. Het Segal-lab (Weizmann) is een pionier in de ontwikkeling van verschillende van dergelijke methoden in vergelijkbare omgevingen op het gebied van genregulatie. De onderzoekers zullen ook een soortgelijk schema gebruiken om de continue EDSS-score te voorspellen die de ernst van MS vertegenwoordigt. De probleemopzet is vergelijkbaar met classificatie, maar de ontwikkeling van de methode is heel anders, aangezien de classificatiemethoden worden vervangen door methoden van het regressietype (bijv. lineaire regressie, probabilistische modellen, stochastische gradiëntafdaling).