Dechifrering af tarmmikrobiotaens rolle i multipel sklerose

Beskrivelse af metoder og driftsplan

Vores forskningsplan består af følgende trin:

1. Kohortesamling. For hvert af ovenstående mål vil efterforskerne bruge Sheba Medical Centers unikke database til at identificere de relevante personer og invitere dem til at deltage i undersøgelsen. Prof. Achiron har stor erfaring med at udføre mange forskningsprojekter, der udnytter den unikke patientdatabase, som centret har til rådighed. For det første mål at sammenligne MS-patienter med raske individer vil efterforskerne udvælge køns-, alders- og diætmatchede raske individer, og ideelt set vælge ægtefæller til MS-patienter som sunde kontroller, da individer, der lever i samme miljø, har mere ens mikrobiota. I vores andet mål, der sammenligner MS-patienter med lignende tid fra diagnosen, men med forskellig sygdomsgrad, vil efterforskerne udvælge MS-patienter, der spænder over det størst mulige spektrum af sygdommens sværhedsgrad, vurderet ud fra EDSS-scoren, som centret anvender. Til det endelige formål vil personer med høj risiko for tilbagefald blive inviteret til profilering hver 6. måned, og hvis der opstår tilbagefald, vil de blive profileret ved deres besøg på centret samt en måned efter tilbagefaldshændelsen.
2. Kohorteprofilering. Fra hver patient vil efterforskerne indhente multidimensionelle data fra MS-databasen, der efter behov består af en undergruppe af: (1) Kliniske metadata, herunder: Samtykkeformular; Medicin; årlig tilbagefaldsrate; (2) Blodprøver, herunder en fuldstændig blodtælling, fuldstændig biokemi, lipidprofil, kolesterolprofil; (3) Fuldstændig neurologisk undersøgelse for at opnå en EDSS-score, kognitiv vurdering, gangvurdering; MR-billeddannelsesdata, fremkaldte potentialer, behandlingsrespons; (4) Blodprøver vil blive behandlet til protein-mRNA-ekspression, og perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) vil blive adskilt på Ficoll-Hypaque-gradient, totalt RNA oprenset, mærket, hybridiseret til Genechip-array (U133A2) og scannet (GeneArray-TM-scanner G2500A; Hewlett Packard) i henhold til producentens protokol (Affymetrix, Santa Clara, CA). MAS5-software (Affymetrix) vil blive brugt til at analysere de scannede arrays indeholdende ~22.000 gentransskriptioner svarende til 14.500 velannoterede humane gener. (5) Tarmmikrobiotaprofil opnået fra afføringsprøver vil blive behandlet til shotgun metagenomisk sekventering og 16S rRNA-profilering. Tarmmikrobiotaprofilering vil blive udført fra afføringsprøver, der straks vil blive flash-frosset i flydende nitrogen og konserveret ved minimum -80°C indtil videre behandling. Prøver vil derefter blive behandlet af en automatiseret robotrørledning, der blev udviklet i Segal-laboratoriet hos Weizmann. Denne pipeline fungerer i 96-brønds format og kan udtrække DNA fra 96 ​​afføringsprøver inden for én dag, forberede DNA Illumina-biblioteker til shotgun metagenomisk sekventering inden for en anden dag og udføre multiplekset polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation af 16S rRNA-genet i en anden dag. dag. Således kan hver 96-afføringsprøvegruppe, der indsamles, behandles robotisk til både 16S og metagenomisk sekventering inden for 3 dage under opsyn af en laborant.
3. Dataanalyse og algoritmisk udvikling. (I) Mikrobiota: For udførligt at studere mikrobiomets rolle i MS, vil efterforskerne gå meget ud over standard 16S rRNA-analysen og i analyse af fuldhaglgeværmetagenomprøver. Ved at sekventere hele DNA-indholdet i afføringsprøver kan metagenom-sekventering potentielt give meget mere information sammenlignet med 16S, da det giver mulighed for at studere genomstruktur, strukturelle varianter og gen- og metaboliske pathway-funktioner. Efter at have udvundet disse funktioner fra mikrobiomet (se nedenfor i de foreløbige resultater), vil efterforskerne starte med at anvende grundlæggende univariate og multivariate associationstests og fortsætte med mere komplekse maskinlæringsmodeller, der forsøger at skelne individer med MS fra dem uden baseret på mikrobiomfunktioner (mål 1), at klassificere sygdoms sværhedsgrad (mål 2), at forudsige tilbagefaldsrisiko (mål 3), at skelne mellem MS-sygdomsfænotyper, dvs. radiologisk isoleret syndrom (RIS), klinisk isoleret syndrom (CIS), recidiverende-remitterende MS ( RRMS), primær-progressiv MS (PPMS), (mål 4) og at identificere behandlingsrespondere (mål 5). (II) Blod: At analysere proteinekspression Partek Genomics Software (www.partek.com) vil blive brugt.
4. Univariate og multivariate analyser. Efterforskerne vil først beregne korrelationen (Pearson og Spearman) mellem alle mikrobiom-træk udtrukket på tværs af alle profilerede individer og de forskellige patientmålinger (EDSS-score, tid fra tilbagefald osv.) og korrigere for de mange udførte hypoteser. Da efterforskerne vil generere et stort antal mikrobiom-træk, og mange af dem er stærkt korrelerede med hinanden, kan denne analyse lide af mangel på statistisk kraft, især i betragtning af, at antallet af deltagere vil være langt mindre end antallet af funktioner. Af denne grund vil efterforskerne også udføre multivariate analyser (f.eks. singular værdi dekomponering, principal komponent analyse), da nøglekomponenterne identificeret af disse metoder fanger hovedvariationen i dataene på en måde, der tager højde for den interne struktur og relationer mellem de forskellige inputfunktioner. Efterforskerne vil derefter teste, om projektioner af data fra nogen af ​​hovedkomponenterne i denne analyse giver en signifikant adskillelse af deltagerne ved deres målte metaboliske parametre. Som en anden type multivariat analyse vil efterforskerne også anvende forskellige uovervågede klyngemetoder (f.eks. hierarkisk klyngedannelse, naive Bayes) til at klynge deltagerne ud fra deres mikrobiomfunktionsdata og derefter undersøge klyngene for berigelse i normale eller unormale metaboliske parametre.

Maskinlæringsalgoritmer. Som en mere global tilgang rettet mod at kvantificere mikrobiomets overordnede bidrag til MS og optrevle det relative bidrag fra de forskellige mikrobiometræk, vil efterforskerne klassificere undersøgelsens deltagere i flere grupper i hvert mål (f.eks. i mål 1-patienter versus raske individer; i mål 2 individer med høj versus lav EDSS-score for samme tid fra MS-diagnose), og udvikle forskellige beregningsmetoder (f.eks. boostede beslutningstræer, Support Vector Machine-algoritmer (SVM'er)) til dette klassifikationsproblem ved kun at bruge mikrobiomfunktionerne genereret ovenfor. Efterforskerne vil bruge et krydsvalideringsskema, hvor modeltræningen udføres på data fra en tilfældigt udvalgt delmængde af deltagere og derefter testes på data fra de resterende holdt ude deltagere. Derudover vil efterforskerne lægge et testsæt til side, hvor efterforskerne vil evaluere den endelige model, der er afledt i krydsvalidering, hvilket muliggør et sandt estimat af vores modellers ydeevne. Da antallet af mikrobiomegenskaber og dermed antallet af dimensioner er stort, vil efterforskerne anvende forskellige tilgange til udvælgelse af funktioner som midler til at undgå overtilpasning og reducere dimensionalitet. Segal-laboratoriet (Weizmann) har været banebrydende i udviklingen af ​​flere sådanne metoder i lignende omgivelser inden for genregulering. Efterforskerne vil også bruge et lignende skema til at forudsige den kontinuerlige EDSS-score, der repræsenterer MS-sværhedsgrad. Problemopsætningen ligner klassifikation, men metodeudviklingen er ret anderledes, da klassifikationsmetoderne er erstattet med metoder af regressionstype (f.eks. lineær regression, probabilistiske modeller, stokastisk gradientnedstigning).