다발성 경화증에서 장내 미생물군의 역할 해독

방법 및 운영 계획 설명

우리의 연구 계획은 다음 단계로 구성됩니다.

1. 코호트 조립. 위의 각 목적을 위해 조사관은 Sheba Medical Center의 고유한 데이터베이스를 사용하여 관련 개인을 식별하고 연구에 참여하도록 초대합니다. Achiron 교수는 센터에서 사용할 수 있는 고유한 환자 데이터베이스를 활용하는 많은 연구 프로젝트를 수행한 경험이 많습니다. MS 환자를 건강한 개인과 비교하는 첫 번째 목표를 위해 조사자는 성별, 연령 및 식단이 일치하는 건강한 개인을 선택하고 이상적으로는 동일한 환경에 사는 개인이 더 유사한 미생물을 가지고 있으므로 MS 환자의 배우자를 건강한 대조군으로 선택합니다. 두 번째 목표는 진단 시간은 비슷하지만 질병 중증도는 다른 MS 환자를 비교하는 것입니다. 조사관은 센터에서 사용하는 EDSS 점수로 판단하여 가능한 가장 큰 질병 중증도 스펙트럼에 걸쳐 있는 MS 환자를 선택합니다. 최종 목표를 위해 재발 위험이 높은 개인은 6개월마다 프로파일링을 위해 초대되며, 재발이 발생하면 센터 방문 시와 재발 사건 후 1개월 후에 프로파일링됩니다.
2. 코호트 프로파일링. 각 환자로부터 조사관은 적절하게 다음의 하위 집합으로 구성된 MS 데이터베이스에서 다차원 데이터를 얻습니다. (1) 다음을 포함하는 임상 메타데이터: 동의서 양식; 약물; 연간 재발률; (2) 전체 혈구 수, 전체 생화학, 지질 프로파일, 콜레스테롤 프로파일을 포함한 혈액 검사; (3) EDSS 점수, 인지 평가, 보행 평가를 얻기 위한 완전한 신경학적 검사; MRI 영상 데이터, 유발 전위, 치료 반응; (4) 단백질 mRNA 발현을 위해 혈액 샘플을 처리하고 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Hypaque 구배로 분리하고, 전체 RNA를 정제하고, 표지하고, Genechip 어레이(U133A2)에 혼성화하고, 스캔(GeneArray-TM 스캐너)합니다. 제조업체의 프로토콜(Affymetrix, Santa Clara, CA)에 따라 G2500A; Hewlett Packard). MAS5 소프트웨어(Affymetrix)는 주석이 잘 달린 14,500개의 인간 유전자에 해당하는 ~22,000개의 유전자 전사물을 포함하는 스캔된 어레이를 분석하는 데 사용됩니다. (5) 대변 샘플에서 얻은 장내 미생물군 프로파일은 샷건 메타게노믹 시퀀싱 및 16S rRNA 프로파일링을 위해 처리됩니다. 장내 미생물 프로파일링은 액체 질소에서 즉시 급속 냉동되고 추가 처리가 될 때까지 최소 -80°C에서 보존되는 대변 샘플에서 수행됩니다. 그런 다음 샘플은 Weizmann의 Segal 연구소에서 개발된 자동화된 로봇 파이프라인에 의해 처리됩니다. 이 파이프라인은 96-웰 형식으로 작동하며 하루 안에 96개의 대변 샘플에서 DNA를 추출하고, 다른 날에 Shotgun metagenomic 시퀀싱을 위한 DNA Illumina 라이브러리를 준비하고, 다른 날에 16S rRNA 유전자의 다중 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행할 수 있습니다. 낮. 따라서 수집된 모든 96개의 대변 샘플 그룹은 한 명의 실험실 기술자의 감독하에 3일 이내에 16S 및 metagenomic 시퀀싱 모두를 위해 로봇으로 처리될 수 있습니다.
3. 데이터 분석 및 알고리즘 개발. (I) 미생물군: MS에서 미생물군집의 역할을 포괄적으로 연구하기 위해 연구자들은 표준 16S rRNA 분석을 훨씬 뛰어넘어 전체 샷건 메타게놈 샘플 분석에 들어갈 것입니다. 대변 ​​샘플의 전체 DNA 내용물을 시퀀싱함으로써 메타게놈 시퀀싱은 게놈 구조, 구조 변이, 유전자 및 대사 경로 기능을 연구할 수 있으므로 16S에 비해 잠재적으로 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 마이크로바이옴에서 이러한 기능을 추출한 후(예비 결과의 아래 참조) 조사관은 기본 단변량 및 다변량 연관 테스트를 사용하여 시작하고 마이크로바이옴 기능을 기반으로 MS가 있는 개인과 그렇지 않은 개인을 구별하려고 시도하는 더 복잡한 기계 학습 모델을 계속합니다. (목표 1), 질병 중증도 분류(목표 2), 재발 위험 예측(목표 3), 다발성 경화증 표현형, 즉 방사선학적 고립 증후군(RIS), 임상적 고립 증후군(CIS), 재발 완화 MS( RRMS), 1차-진행성 MS(PPMS), (목표 4), 치료 반응자 식별(목표 5). (II) 혈액: 단백질 발현 분석을 위한 Partek Genomics Software(www.partek.com) 사용하게 될 것이다.
4. 단변량 및 다변량 분석. 조사관은 먼저 프로파일링된 모든 개인에서 추출된 모든 미생물군 특징과 다른 환자 측정치(EDSS 점수, 재발 후 시간 등) 사이의 상관관계(Pearson 및 Spearman)를 계산하고 수행된 여러 가설을 수정합니다. 조사관은 엄청난 수의 미생물 군집 특징을 생성하고 이들 중 많은 부분이 서로 높은 상관 관계가 있기 때문에 특히 참가자 수가 특징 수보다 훨씬 적다는 점을 고려할 때 이 분석은 통계적 힘이 부족할 수 있습니다. 이러한 이유로 조사자는 다변량 분석(예: 특이값 분해, 주성분 분석)도 수행할 것입니다. 이러한 방법으로 식별된 주요 구성 요소는 내부 구조와 간의 관계를 고려하는 방식으로 데이터의 주요 변동을 캡처하기 때문입니다. 다른 입력 기능. 그런 다음 조사관은 이 분석의 주요 주요 구성 요소에 의한 데이터 예측이 측정된 대사 매개변수에 따라 참가자를 크게 분리하는지 여부를 테스트합니다. 다른 유형의 다변량 분석으로서, 조사관은 또한 서로 다른 감독되지 않은 클러스터링 방법(예: 계층적 클러스터링, 순진한 베이즈)을 사용하여 참가자를 미생물군 특징 데이터로 클러스터링한 다음 정상 또는 비정상 대사 매개변수의 농축을 위해 클러스터를 검사합니다.

기계 학습 알고리즘. MS에 대한 마이크로바이옴의 전반적인 기여도를 정량화하고 다양한 마이크로바이옴 특징의 상대적인 기여도를 밝히는 것을 목표로 하는 보다 글로벌한 접근 방식으로 조사관은 연구 참가자를 각 목표에서 여러 그룹으로 분류할 것입니다(예: 목표 1 환자 대 건강한 개인, MS 진단과 유사한 시간 동안 EDSS 점수가 높거나 낮은 2명의 개인을 목표로 하고, 마이크로바이옴 기능만 사용하여 이 분류 문제에 대한 다양한 계산 방법(예: 부스트 결정 트리, SVM(Support Vector Machine 알고리즘))을 개발합니다. 위에서 생성됨. 조사관은 교차 유효성 검사 체계를 사용하여 무작위로 선택된 참가자 하위 집합의 데이터에 대해 모델 교육을 수행한 다음 나머지 홀드 아웃 참가자의 데이터에 대해 테스트합니다. 또한 조사관은 조사관이 교차 검증에서 파생된 최종 모델을 평가할 테스트 세트를 남겨두고 모델의 성능을 정확하게 추정할 수 있습니다. 마이크로바이옴 특징의 수와 차원의 수가 많기 때문에 조사관은 과적합을 피하고 차원을 줄이는 수단으로 다양한 특징 선택 접근법을 사용할 것입니다. Segal 연구실(Weizmann)은 유전자 조절 영역에서 유사한 환경에서 이러한 여러 방법의 개발을 개척했습니다. 조사관은 또한 MS 중증도를 나타내는 연속 EDSS 점수를 예측하기 위해 유사한 체계를 사용할 것입니다. 문제 설정은 분류와 유사하지만 분류 방법이 회귀 유형의 방법(예: 선형 회귀, 확률 모델, 확률적 경사 하강법)으로 대체되기 때문에 방법 개발이 상당히 다릅니다.