Decifrare il ruolo del microbiota intestinale nella sclerosi multipla

Descrizione delle modalità e piano operativo

Il nostro piano di ricerca si compone delle seguenti fasi:

1. Assemblea di coorte. Per ciascuno degli obiettivi di cui sopra gli investigatori utilizzeranno il database unico dello Sheba Medical Center per identificare le persone interessate e invitarle a prendere parte allo studio. Il Prof. Achiron ha molta esperienza nella conduzione di molti progetti di ricerca che utilizzano l'esclusivo database di pazienti a disposizione del Centro. Per il primo obiettivo, confrontando i pazienti con SM con individui sani, i ricercatori selezioneranno individui sani abbinati a sesso, età e dieta, idealmente selezionando i coniugi di pazienti con SM come controlli sani poiché gli individui che vivono nello stesso ambiente hanno un microbiota più simile. Nel nostro secondo obiettivo, confrontando i pazienti con SM con tempi simili dalla diagnosi ma diversa gravità della malattia, i ricercatori selezioneranno pazienti con SM che coprono il più ampio spettro possibile di gravità della malattia, come giudicato dal punteggio EDSS utilizzato dal Centro. Per l'obiettivo finale, le persone ad alto rischio di ricaduta saranno invitate per la profilazione ogni 6 mesi e se si verifica una ricaduta, saranno profilate durante la loro visita al Centro e un mese dopo l'evento di ricaduta.
2. Profilazione di coorte. Da ciascun paziente, gli investigatori otterranno dati multidimensionali dal database MS costituiti, a seconda dei casi, da un sottoinsieme di: (1) metadati clinici, tra cui: modulo di consenso; farmaci; tasso di recidiva annuale; (2) Esami del sangue, compreso un esame emocromocitometrico completo, biochimica completa, profilo lipidico, profilo del colesterolo; (3) Esame neurologico completo per ottenere un punteggio EDSS, valutazione cognitiva, valutazione dell'andatura; dati di imaging MRI, potenziali evocati, risposta al trattamento; (4) I campioni di sangue saranno processati per l'espressione dell'mRNA proteico e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) saranno separate su gradiente Ficoll-Hypaque, l'RNA totale purificato, etichettato, ibridato con l'array Genechip (U133A2) e scansionato (scanner GeneArray-TM G2500A; Hewlett Packard) secondo il protocollo del produttore (Affymetrix, Santa Clara, CA). Il software MAS5 (Affymetrix) verrà utilizzato per analizzare gli array scansionati contenenti ~22.000 trascritti genici corrispondenti a 14.500 geni umani ben annotati. (5) Il profilo del microbiota intestinale ottenuto dai campioni di feci sarà elaborato per il sequenziamento metagenomico del fucile e la profilazione dell'rRNA 16S. La profilazione del microbiota intestinale verrà eseguita da campioni di feci che verranno immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a un minimo di -80 ° C fino all'ulteriore elaborazione. I campioni verranno quindi elaborati da una pipeline robotica automatizzata sviluppata nel laboratorio Segal di Weizmann. Questa pipeline funziona in formato a 96 pozzetti e può estrarre il DNA da 96 campioni di feci in un giorno, preparare le librerie DNA Illumina per il sequenziamento metagenomico shotgun entro un altro giorno ed eseguire l'amplificazione multiplex della reazione a catena della polimerasi (PCR) del gene 16S rRNA in un altro giorno. Pertanto, ogni gruppo campione di 96 feci raccolto può essere elaborato roboticamente sia per il sequenziamento 16S che metagenomico entro 3 giorni sotto la supervisione di un tecnico di laboratorio.
3. Analisi dei dati e sviluppo algoritmico. (I) Microbiota: per studiare in modo completo il ruolo del microbioma nella SM, i ricercatori andranno molto oltre l'analisi standard dell'rRNA 16S e nell'analisi di campioni completi di metagenoma shotgun. Sequenziando l'intero contenuto di DNA dei campioni di feci, il sequenziamento del metagenoma può potenzialmente fornire molte più informazioni rispetto al 16S, in quanto consente di studiare la struttura del genoma, le varianti strutturali e le funzioni del gene e della via metabolica. Dopo aver estratto queste caratteristiche dal microbioma (vedi sotto in Risultati preliminari), i ricercatori inizieranno impiegando test di associazione univariati e multivariati di base e continueranno con modelli di apprendimento automatico più complessi che tentano di distinguere gli individui con SM da quelli senza in base alle caratteristiche del microbioma (obiettivo 1), classificare la gravità della malattia (obiettivo 2), prevedere il rischio di recidiva (obiettivo 3), differenziare tra i fenotipi della malattia della SM, ovvero sindrome radiologicamente isolata (RIS), sindrome clinicamente isolata (CIS), SM recidivante-remittente (obiettivo 1). RRMS), SM primariamente progressiva (PPMS), (obiettivo 4) e per identificare i responder al trattamento (obiettivo 5). (II) Sangue: per analizzare l'espressione proteica Partek Genomics Software (www.partek.com) sarà usato.
4. Analisi univariata e multivariata. Gli investigatori calcoleranno prima la correlazione (Pearson e Spearman) tra tutte le caratteristiche del microbioma estratte in tutti gli individui profilati e le diverse misurazioni del paziente (punteggio EDSS, tempo dalla ricaduta, ecc.) E correggeranno per le molteplici ipotesi eseguite. Poiché i ricercatori genereranno un vasto numero di caratteristiche del microbioma e molte di esse sono altamente correlate tra loro, questa analisi potrebbe risentire della mancanza di potere statistico, soprattutto dato che il numero di partecipanti sarà molto inferiore al numero di caratteristiche. Per questo motivo, i ricercatori eseguiranno anche analisi multivariate (ad esempio, decomposizione del valore singolare, analisi delle componenti principali) poiché i componenti chiave identificati da questi metodi catturano la variazione principale nei dati in un modo che tiene conto della struttura interna e delle relazioni tra le diverse caratteristiche di input. Gli investigatori verificheranno quindi se le proiezioni dei dati di uno qualsiasi dei principali componenti principali in questa analisi forniscono una segregazione significativa dei partecipanti in base ai loro parametri metabolici misurati. Come diverso tipo di analisi multivariata, i ricercatori impiegheranno anche diversi metodi di clustering senza supervisione (ad esempio, clustering gerarchico, Bayes ingenuo) per raggruppare i partecipanti in base ai dati delle loro caratteristiche del microbioma, quindi esaminare i cluster per l'arricchimento in parametri metabolici normali o anormali.

Algoritmi di apprendimento automatico. Come approccio più globale volto a quantificare il contributo complessivo del microbioma alla SM e a svelare il contributo relativo delle diverse caratteristiche del microbioma, i ricercatori classificheranno i partecipanti allo studio in diversi gruppi in ciascun obiettivo (ad esempio, nell'obiettivo 1 pazienti contro sani individui; nell'obiettivo 2 individui con punteggio EDSS alto o basso per un tempo simile dalla diagnosi di SM) e sviluppare diversi metodi computazionali (ad es. alberi decisionali potenziati, algoritmi Support Vector Machine (SVM)) per questo problema di classificazione utilizzando solo le caratteristiche del microbioma generato sopra. Gli investigatori utilizzeranno uno schema di convalida incrociata, in base al quale la formazione del modello viene eseguita sui dati di un sottoinsieme di partecipanti scelto a caso e quindi testata sui dati dei restanti partecipanti trattenuti. Inoltre, gli investigatori lasceranno da parte un set di test su cui gli investigatori valuteranno il modello finale derivato dalla validazione incrociata, consentendo una stima reale delle prestazioni dei nostri modelli. Poiché il numero di caratteristiche del microbioma e quindi il numero di dimensioni è elevato, i ricercatori impiegheranno vari approcci di selezione delle caratteristiche come mezzo per evitare l'overfitting e ridurre la dimensionalità. Il laboratorio Segal (Weizmann) ha aperto la strada allo sviluppo di molti di questi metodi in contesti simili nell'area della regolazione genica. Gli investigatori utilizzeranno anche uno schema simile per prevedere il punteggio EDSS continuo che rappresenta la gravità della SM. La configurazione del problema è simile alla classificazione, ma lo sviluppo del metodo è piuttosto diverso in quanto i metodi di classificazione vengono sostituiti con metodi di tipo regressivo (ad esempio, regressione lineare, modelli probabilistici, discesa del gradiente stocastico).