Déchiffrer le rôle du microbiote intestinal dans la sclérose en plaques

Description des méthodes et plan d'opération

Notre plan de recherche comprend les étapes suivantes :

1. Assemblée de cohorte. Pour chacun des objectifs ci-dessus, les enquêteurs utiliseront la base de données unique du centre médical Sheba pour identifier les individus concernés et les inviter à participer à l'étude. Le professeur Achiron a beaucoup d'expérience dans la conduite de nombreux projets de recherche qui utilisent la base de données de patients unique disponible au Centre. Pour le premier objectif comparant les patients atteints de SEP à des individus en bonne santé, les chercheurs sélectionneront des individus en bonne santé correspondant au sexe, à l'âge et au régime alimentaire, en sélectionnant idéalement les conjoints des patients atteints de SEP comme témoins sains, car les individus vivant dans le même environnement ont un microbiote plus similaire. Dans notre deuxième objectif comparant les patients atteints de SEP avec un délai similaire depuis le diagnostic mais une gravité de la maladie différente, les chercheurs sélectionneront des patients atteints de SEP qui couvrent le plus large spectre possible de gravité de la maladie, à en juger par le score EDSS utilisé par le Centre. Pour l'objectif final, les personnes à haut risque de rechute seront invitées à un profilage tous les 6 mois et si une rechute se produit, elles seront profilées lors de leur visite au Centre ainsi qu'un mois après l'événement de rechute.
2. Profilage de cohorte. De chaque patient, les enquêteurs obtiendront des données multidimensionnelles de la base de données MS consistant, le cas échéant, en un sous-ensemble de : (1) Métadonnées cliniques, y compris : Formulaire de consentement ; Médicaments; taux de rechute annuel ; (2) Tests sanguins, y compris numération globulaire complète, biochimie complète, profil lipidique, profil de cholestérol; (3) Examen neurologique complet pour l'obtention d'un score EDSS, évaluation cognitive, évaluation de la marche ; Données d'imagerie IRM, potentiels évoqués, réponse au traitement ; (4) Les échantillons de sang seront traités pour l'expression de l'ARNm des protéines et les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) seront séparées sur un gradient de Ficoll-Hypaque, l'ARN total purifié, marqué, hybridé sur le réseau Genechip (U133A2) et scanné (scanner GeneArray-TM G2500A ; Hewlett Packard) selon le protocole du fabricant (Affymetrix, Santa Clara, CA). Le logiciel MAS5 (Affymetrix) sera utilisé pour analyser les puces numérisées contenant environ 22 000 transcrits de gènes correspondant à 14 500 gènes humains bien annotés. (5) Le profil du microbiote intestinal obtenu à partir d'échantillons de selles sera traité pour le séquençage métagénomique shotgun et le profilage de l'ARNr 16S. Le profilage du microbiote intestinal sera effectué à partir d'échantillons de selles qui seront immédiatement surgelés dans de l'azote liquide et conservés à un minimum de -80 °C jusqu'à un traitement ultérieur. Les échantillons seront ensuite traités par un pipeline robotisé automatisé qui a été développé dans le laboratoire Segal de Weizmann. Ce pipeline fonctionne au format 96 puits et peut extraire l'ADN de 96 échantillons de selles en un jour, préparer des bibliothèques d'ADN Illumina pour le séquençage métagénomique shotgun en un autre jour et effectuer une amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) multiplexée du gène ARNr 16S dans un autre jour. Ainsi, chaque groupe d'échantillons de 96 selles collectés peut être traité de manière robotique pour le séquençage 16S et métagénomique dans les 3 jours sous la supervision d'un technicien de laboratoire.
3. Analyse de données et développement algorithmique. (I) Microbiote : Pour étudier de manière approfondie le rôle du microbiome dans la SEP, les chercheurs iront bien au-delà de l'analyse standard de l'ARNr 16S et s'intéresseront à l'analyse d'échantillons de métagénomes complets. En séquençant tout le contenu en ADN des échantillons de selles, le séquençage du métagénome peut potentiellement fournir beaucoup plus d'informations par rapport au 16S, car il permet d'étudier la structure du génome, les variantes structurelles et les fonctions des gènes et des voies métaboliques. Après avoir extrait ces caractéristiques du microbiome (voir ci-dessous dans les résultats préliminaires), les chercheurs commenceront par utiliser des tests d'association univariés et multivariés de base, et continueront avec des modèles d'apprentissage automatique plus complexes qui tentent de distinguer les individus atteints de SEP de ceux qui n'en ont pas en fonction des caractéristiques du microbiome. (objectif 1), classer la gravité de la maladie (objectif 2), prédire le risque de rechute (objectif 3), différencier les phénotypes de la SEP, c'est-à-dire le syndrome radiologiquement isolé (RIS), le syndrome cliniquement isolé (CIS), la SEP récurrente-rémittente ( SEP-RR), SEP primaire progressive (PPMS) (objectif 4) et identifier les répondeurs au traitement (objectif 5). (II) Sang : Pour analyser l'expression des protéines Partek Genomics Software (www.partek.com) sera utilisé.
4. Analyses univariées et multivariées. Les chercheurs calculeront d'abord la corrélation (Pearson et Spearman) entre toutes les caractéristiques du microbiome extraites de tous les individus profilés et les différentes mesures des patients (score EDSS, temps écoulé depuis la rechute, etc.), et corrigeront les multiples hypothèses effectuées. Étant donné que les chercheurs généreront un grand nombre de caractéristiques du microbiome et que nombre d'entre elles sont fortement corrélées les unes aux autres, cette analyse peut souffrir d'un manque de puissance statistique, d'autant plus que le nombre de participants sera bien inférieur au nombre de caractéristiques. Pour cette raison, les enquêteurs effectueront également des analyses multivariées (p. les différentes caractéristiques d'entrée. Les enquêteurs testeront ensuite si les projections des données par l'un des principaux composants principaux de cette analyse fournissent une ségrégation significative des participants par leurs paramètres métaboliques mesurés. En tant que type différent d'analyse multivariée, les chercheurs utiliseront également différentes méthodes de regroupement non supervisées (par exemple, regroupement hiérarchique, Bayes naïf) pour regrouper les participants en fonction de leurs données sur les caractéristiques du microbiome, puis examineront les grappes pour l'enrichissement en paramètres métaboliques normaux ou anormaux.

Algorithmes d'apprentissage automatique. En tant qu'approche plus globale visant à quantifier la contribution globale du microbiome à la SEP et à démêler la contribution relative des différentes caractéristiques du microbiome, les chercheurs classeront les participants à l'étude en plusieurs groupes dans chaque objectif (par exemple, dans l'objectif 1, les patients par rapport aux patients en bonne santé individus ; dans l'objectif 2 individus avec un score EDSS élevé ou faible pendant la même période depuis le diagnostic de SEP), et développer différentes méthodes de calcul (par exemple, des arbres de décision renforcés, des algorithmes de machine à vecteurs de support (SVM)) pour ce problème de classification en utilisant uniquement les caractéristiques du microbiome généré ci-dessus. Les enquêteurs utiliseront un schéma de validation croisée, dans lequel la formation du modèle est effectuée sur les données d'un sous-ensemble de participants choisis au hasard, puis testée sur les données des participants restants. De plus, les enquêteurs laisseront de côté un jeu de test sur lequel les enquêteurs évalueront le modèle final qui est dérivé en validation croisée, permettant une véritable estimation des performances de nos modèles. Comme le nombre de caractéristiques du microbiome et donc le nombre de dimensions est important, les chercheurs utiliseront diverses approches de sélection des caractéristiques pour éviter le surajustement et réduire la dimensionnalité. Le laboratoire Segal (Weizmann) a été le pionnier du développement de plusieurs de ces méthodes dans des contextes similaires dans le domaine de la régulation des gènes. Les enquêteurs utiliseront également un schéma similaire pour prédire le score EDSS continu représentant la gravité de la SEP. La configuration du problème est similaire à la classification, mais le développement de la méthode est assez différent car les méthodes de classification sont remplacées par des méthodes de type régression (par exemple, régression linéaire, modèles probabilistes, descente de gradient stochastique).