A bélmikrobióta szerepének megfejtése a sclerosis multiplexben

A módszerek és a működési terv leírása

Kutatási tervünk a következő lépésekből áll:

1. Kohorsz összeállítás. A fenti célok mindegyikéhez a vizsgálók a Sheba Medical Center egyedi adatbázisát fogják használni, hogy azonosítsák az érintett személyeket, és felkérjék őket, hogy vegyenek részt a vizsgálatban. Prof. Achiron nagy tapasztalattal rendelkezik számos olyan kutatási projekt lebonyolításában, amelyek a Központ rendelkezésére álló egyedülálló betegadatbázist használják fel. Az SM-betegek és az egészséges egyének összehasonlítása során a kutatók a nemnek, életkornak és étrendnek megfelelő egészséges egyéneket választanak ki, ideális esetben az SM-betegek házastársát választják egészséges kontrollként, mivel az azonos környezetben élő egyének mikrobiotája hasonlóbb. Második célunk, hogy összehasonlítsuk a diagnózistól számított hasonló idővel, de eltérő súlyosságú SM-betegeket, a vizsgálók olyan SM betegeket választanak ki, akik a betegség súlyosságának lehető legnagyobb spektrumát fedik le, a Központ által alkalmazott EDSS pontszám alapján. A végső cél érdekében a visszaesés nagy kockázatának kitett személyeket 6 havonta profilalkotásra hívják meg, és ha visszaesik, akkor a Központban tett látogatásukkor, valamint egy hónappal a visszaesés után.
2. Kohorsz profilalkotás. A vizsgálók minden egyes pácienstől többdimenziós adatokat kapnak az SM-adatbázisból, amely adott esetben a következők egy részéből áll: (1) Klinikai metaadatok, beleértve: Beleegyezési űrlap; Gyógyszerek; éves visszaesési arány; (2) Vérvizsgálatok, beleértve a teljes vérképet, teljes biokémiát, lipidprofilt, koleszterinprofilt; (3) Teljes neurológiai vizsgálat az EDSS pontszám megszerzéséhez, kognitív értékelés, járásértékelés; MRI képalkotó adatok, kiváltott potenciálok, kezelésre adott válasz; (4) A vérmintákat fehérje-mRNS-expresszióra dolgozzák fel, és a perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) Ficoll-Hypaque gradiensen elválasztják, a teljes RNS-t tisztítják, jelölik, Genechip-tömbhöz hibridizálják (U133A2) és szkennelik (GeneArray-TM szkenner). G2500A; Hewlett Packard) a gyártó protokollja szerint (Affymetrix, Santa Clara, CA). A MAS5 szoftvert (Affymetrix) fogják használni a szkennelt tömbök elemzésére, amelyek körülbelül 22 000 génátiratot tartalmaznak, amelyek 14 500 jól jelzett emberi génnek felelnek meg. (5) A székletmintákból nyert bélmikrobióta-profilt sörétes metagenomikus szekvenáláshoz és 16S rRNS-profilokhoz dolgozzák fel. A bélmikrobióta profilozása székletmintákból történik, amelyeket azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztanak, és további feldolgozásig legalább -80 °C-on tárolják. A mintákat ezután egy automatizált robotcsővel dolgozzák fel, amelyet a weizmann-i Segal laboratóriumban fejlesztettek ki. Ez a csővezeték 96 lyukú formátumban működik, és egy napon belül 96 székletmintából DNS-t tud kinyerni, egy másik napon belül DNS Illumina könyvtárakat készít elő shotgun metagenomikus szekvenáláshoz, és egy másikban hajtja végre a 16S rRNS gén multiplex polimeráz láncreakció (PCR) amplifikációját. nap. Így minden begyűjtött 96 székletből álló mintacsoport egy labortechnikus felügyelete mellett 3 napon belül robotosan feldolgozható mind a 16S, mind a metagenomikus szekvenáláshoz.
3. Adatelemzés és algoritmikus fejlesztés. (I) Mikrobióta: A mikrobiom SM-ben betöltött szerepének átfogó tanulmányozása érdekében a kutatók sokkal túlmutatnak a standard 16S rRNS-elemzésen, és a teljes shotgun metagenom minták elemzésén is részt vesznek. A székletminták teljes DNS-tartalmának szekvenálásával a metagenom szekvenálás potenciálisan sokkal több információt szolgáltathat a 16S-hez képest, mivel lehetővé teszi a genom szerkezetének, szerkezeti változatainak, valamint a gén- és metabolikus útvonalak funkcióinak tanulmányozását. Miután kivonták ezeket a jellemzőket a mikrobiomból (lásd alább az előzetes eredményeket), a kutatók alapvető egyváltozós és többváltozós asszociációs tesztekkel kezdik, majd folytatják az összetettebb gépi tanulási modellekkel, amelyek a mikrobiom jellemzői alapján megkísérlik megkülönböztetni az SM-ben szenvedőket a nem szenvedőktől. (1. cél), a betegség súlyosságának osztályozása (2. cél), a relapszus kockázatának előrejelzése (3. cél), az SM betegség fenotípusainak megkülönböztetése, azaz a radiológiailag izolált szindróma (RIS), a klinikailag izolált szindróma (CIS), a relapszus-remittáló SM ( RRMS), primer-progresszív MS (PPMS) (4. cél), valamint a kezelésre reagálók azonosítása (5. cél). (II) Vér: A fehérjeexpresszió elemzéséhez Partek Genomics Software (www.partek.com) használva lesz.
4. Egyváltozós és többváltozós elemzések. A kutatók először kiszámítják a korrelációt (Pearson és Spearman) az összes profilozott egyénből kinyert összes mikrobióm-jellemző és a különböző betegek mérései között (EDSS-pontszám, relapszustól eltelt idő stb.), és kijavítják az elvégzett több hipotézist. Mivel a kutatók nagyszámú mikrobióm-jellemzőt fognak generálni, és ezek közül sok erősen korrelál egymással, ez az elemzés a statisztikai erő hiányától szenvedhet, különösen, ha a résztvevők száma sokkal kisebb lesz, mint a jellemzők száma. Emiatt a vizsgálók többváltozós elemzéseket is végeznek (pl. szinguláris értékbontás, főkomponens-elemzés), mivel az ezekkel a módszerekkel azonosított kulcsfontosságú komponensek olyan módon rögzítik az adatok fő változásait, amelyek figyelembe veszik a belső szerkezetet és az egymás közötti kapcsolatokat. a különböző bemeneti funkciókat. A kutatók ezt követően megvizsgálják, hogy az adatoknak az ebben az elemzésben szereplő fő összetevők valamelyikére vonatkozó előrejelzések biztosítják-e a résztvevők szignifikáns elkülönítését mért metabolikus paramétereik alapján. A többváltozós elemzés egy másik típusaként a kutatók különböző felügyelt klaszterezési módszereket is alkalmaznak (pl. hierarchikus klaszterezés, naiv Bayes), hogy a résztvevőket mikrobiom jellemzői adataik alapján csoportosítsák, majd megvizsgálják, hogy a klaszterek feldúsultak-e normális vagy abnormális metabolikus paraméterekben.

Gépi tanulási algoritmusok. A mikrobiom SM-hez való általános hozzájárulásának számszerűsítésére és a különböző mikrobióm jellemzők relatív hozzájárulásának feltárására irányuló átfogóbb megközelítésként a kutatók a vizsgálat résztvevőit minden célban több csoportba sorolják (pl. az 1. célban a betegek kontra egészségesek). egyének; célozzon meg 2 egyéneket magas vagy alacsony EDSS-pontszámmal az SM-diagnózistól számított hasonló időre, és dolgozzon ki különböző számítási módszereket (pl. megnövelt döntési fákat, Support Vector Machine algoritmusokat (SVM-ek)) erre az osztályozási problémára, kizárólag a mikrobiom jellemzőit használva. fent generált. A kutatók keresztvalidációs sémát alkalmaznak, ahol a modellképzést a résztvevők véletlenszerűen kiválasztott részhalmazának adatain végzik el, majd a fennmaradó kitartott résztvevők adatain tesztelik. Ezen túlmenően a vizsgálók félre fognak hagyni egy tesztkészletet, amelyen a vizsgálók értékelik a keresztvalidáció során levezetett végső modellt, lehetővé téve modelljeink teljesítményének valós becslését. Mivel a mikrobiom jellemzőinek száma és így a dimenziók száma is nagy, a kutatók különféle jellemző-kiválasztási megközelítéseket alkalmaznak a túlillesztés elkerülése és a dimenziók csökkentése érdekében. A Segal labor (Weizmann) úttörő szerepet játszott több ilyen módszer kifejlesztésében hasonló környezetben a génszabályozás területén. A kutatók hasonló sémát fognak használni az SM súlyosságát reprezentáló folyamatos EDSS-pontszám előrejelzésére is. A probléma felállítása hasonló az osztályozáshoz, de a módszerfejlesztés egészen más, mivel az osztályozási módszereket regressziós típusú módszerek váltják fel (pl. lineáris regresszió, valószínűségi modellek, sztochasztikus gradiens süllyedés).