Decifrando o papel da microbiota intestinal na esclerose múltipla

Descrição dos métodos e plano de operação

Nosso plano de pesquisa consiste nas seguintes etapas:

1. Assembleia de coorte. Para cada um dos objetivos acima, os investigadores usarão o banco de dados exclusivo do Sheba Medical Center para identificar os indivíduos relevantes e convidá-los a participar do estudo. O Prof. Achiron tem muita experiência na condução de muitos projetos de pesquisa que utilizam o banco de dados exclusivo de pacientes disponível no Centro. Para o primeiro objetivo, comparando pacientes com EM a indivíduos saudáveis, os investigadores selecionarão indivíduos saudáveis ​​pareados por sexo, idade e dieta, idealmente selecionando cônjuges de pacientes com EM como controles saudáveis, pois os indivíduos que vivem no mesmo ambiente têm microbiota mais semelhante. Em nosso segundo objetivo, comparando pacientes com EM com tempo semelhante desde o diagnóstico, mas gravidade diferente da doença, os investigadores selecionarão pacientes com EM que abrangem o maior espectro possível de gravidade da doença, conforme julgado pelo escore EDSS empregado pelo Centro. Para o objetivo final, os indivíduos com alto risco de recaída serão convidados para perfis a cada 6 meses e, se ocorrer recaída, eles serão perfilados na visita ao Centro, bem como um mês após o evento de recaída.
2. Perfil de coorte. De cada paciente, os investigadores obterão dados multidimensionais do banco de dados do MS consistindo, conforme apropriado, de um subconjunto de: (1) Metadados clínicos, incluindo: Formulário de consentimento; Medicamentos; taxa de recaída anual; (2) Exames de sangue, incluindo hemograma completo, bioquímica completa, perfil lipídico, perfil de colesterol; (3) Exame neurológico completo para obter uma pontuação EDSS, avaliação cognitiva, avaliação da marcha; dados de imagem de ressonância magnética, potenciais evocados, resposta ao tratamento; (4) Amostras de sangue serão processadas para expressão de mRNA de proteína e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) serão separadas em gradiente Ficoll-Hypaque, RNA total purificado, marcado, hibridizado com Genechip array (U133A2) e escaneado (scanner GeneArray-TM G2500A; Hewlett Packard) de acordo com o protocolo do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). O software MAS5 (Affymetrix) será usado para analisar as matrizes digitalizadas contendo ~22.000 transcrições de genes correspondentes a 14.500 genes humanos bem anotados. (5) O perfil da microbiota intestinal obtido de amostras de fezes será processado para sequenciamento metagenômico shotgun e perfil de 16S rRNA. O perfil da microbiota intestinal será feito a partir de amostras de fezes que serão imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e preservadas a um mínimo de -80°C até o processamento posterior. As amostras serão então processadas por um pipeline robótico automatizado que foi desenvolvido no laboratório Segal em Weizmann. Este pipeline funciona em formato de 96 poços e pode extrair DNA de 96 amostras de fezes em um dia, preparar bibliotecas de DNA Illumina para sequenciamento metagenômico shotgun em outro dia e realizar amplificação multiplexada por reação em cadeia da polimerase (PCR) do gene 16S rRNA em outro dia dia. Assim, cada grupo de amostra de 96 fezes coletado pode ser processado roboticamente para 16S e sequenciamento metagenômico dentro de 3 dias sob a supervisão de um técnico de laboratório.
3. Análise de dados e desenvolvimento algorítmico. (I) Microbiota: Para estudar de forma abrangente o papel do microbioma na EM, os investigadores vão muito além da análise padrão de 16S rRNA e analisam amostras completas de metagenoma shotgun. Ao sequenciar todo o conteúdo de DNA das amostras de fezes, o sequenciamento de metagenoma pode potencialmente fornecer muito mais informações em comparação com o 16S, pois permite estudar a estrutura do genoma, variantes estruturais e funções de genes e vias metabólicas. Depois de extrair esses recursos do microbioma (veja abaixo em Resultados Preliminares), os investigadores começarão empregando testes básicos de associação univariada e multivariada e continuarão com modelos de aprendizado de máquina mais complexos que tentam distinguir indivíduos com EM daqueles sem, com base nos recursos do microbioma. (objetivo 1), para classificar a gravidade da doença (objetivo 2), para prever o risco de recaída (objetivo 3), para diferenciar entre os fenótipos da doença de EM, ou seja, síndrome radiologicamente isolada (RIS), síndrome clinicamente isolada (CIS), EM remitente-recorrente ( EMRR), EM primária progressiva (EMPP), (objetivo 4) e para identificar os respondedores ao tratamento (objetivo 5). (II) Sangue: Para analisar a expressão da proteína Partek Genomics Software (www.partek.com) será usado.
4. Análises univariadas e multivariadas. Os investigadores primeiro calcularão a correlação (Pearson e Spearman) entre todas as características do microbioma extraídas em todos os indivíduos com perfil e as diferentes medições do paciente (pontuação EDSS, tempo desde a recaída, etc.) e corrigirão as múltiplas hipóteses realizadas. Uma vez que os investigadores irão gerar um grande número de características do microbioma e muitos deles são altamente correlacionados entre si, esta análise pode sofrer de falta de poder estatístico, especialmente porque o número de participantes será muito menor do que o número de características. Por esse motivo, os investigadores também realizarão análises multivariadas (por exemplo, decomposição de valor singular, análise de componentes principais), uma vez que os principais componentes identificados por esses métodos capturam a principal variação nos dados de uma forma que leva em conta a estrutura interna e as relações entre os diferentes recursos de entrada. Os investigadores testarão então se as projeções dos dados por qualquer um dos principais componentes principais nesta análise fornecem uma segregação significativa dos participantes por seus parâmetros metabólicos medidos. Como um tipo diferente de análise multivariada, os investigadores também empregarão diferentes métodos de agrupamento não supervisionados (por exemplo, agrupamento hierárquico, Naïve Bayes) para agrupar os participantes por seus dados de características do microbioma e, em seguida, examinar os agrupamentos para enriquecimento em parâmetros metabólicos normais ou anormais.

Algoritmos de aprendizado de máquina. Como uma abordagem mais global destinada a quantificar a contribuição geral do microbioma para a EM e desvendar a contribuição relativa das diferentes características do microbioma, os investigadores classificarão os participantes do estudo em vários grupos em cada objetivo (por exemplo, no objetivo 1, pacientes versus saudáveis indivíduos; no objetivo 2 indivíduos com pontuação EDSS alta versus baixa para o tempo semelhante do diagnóstico de EM) e desenvolver diferentes métodos computacionais (por exemplo, árvores de decisão reforçadas, algoritmos de Support Vector Machine (SVMs)) para este problema de classificação usando apenas os recursos do microbioma gerado acima. Os investigadores usarão um esquema de validação cruzada, em que o treinamento do modelo é feito nos dados de um subconjunto de participantes escolhidos aleatoriamente e, em seguida, testado nos dados dos participantes remanescentes. Além disso, os investigadores deixarão de lado um conjunto de testes no qual os investigadores avaliarão o modelo final derivado na validação cruzada, permitindo uma estimativa real do desempenho de nossos modelos. Como o número de recursos do microbioma e, portanto, o número de dimensões é grande, os investigadores empregarão várias abordagens de seleção de recursos como forma de evitar o overfitting e reduzir a dimensionalidade. O laboratório Segal (Weizmann) foi pioneiro no desenvolvimento de vários desses métodos em configurações semelhantes na área de regulação de genes. Os investigadores também usarão um esquema semelhante para prever a pontuação contínua de EDSS que representa a gravidade da EM. A configuração do problema é semelhante à classificação, mas o desenvolvimento do método é bastante diferente, pois os métodos de classificação são substituídos por métodos do tipo regressão (por exemplo, regressão linear, modelos probabilísticos, descida de gradiente estocástico).