Suoliston mikrobiotan roolin selvittäminen multippeliskleroosissa

Menetelmien kuvaus ja toimintasuunnitelma

Tutkimussuunnitelmamme koostuu seuraavista vaiheista:

1. Kohorttikokoonpano. Kussakin edellä mainitussa tarkoituksessa tutkijat käyttävät Sheba Medical Centerin ainutlaatuista tietokantaa tunnistaakseen asiaankuuluvat henkilöt ja kutsuakseen heidät osallistumaan tutkimukseen. Professori Achironilla on paljon kokemusta monista tutkimusprojekteista, joissa hyödynnetään keskuksen käytettävissä olevaa ainutlaatuista potilastietokantaa. Ensimmäiseksi tavoitteeksi verrata MS-potilaita terveisiin yksilöihin tutkijat valitsevat sukupuolen, iän ja ruokavalion mukaan sopivat terveet yksilöt. Ihannetapauksessa MS-potilaiden puolisot valitaan terveiksi kontrolleiksi, koska samassa ympäristössä asuvilla yksilöillä on enemmän samankaltaista mikrobistoa. Toisessa tavoitteessamme vertailla MS-potilaita, joilla on samanlainen aika diagnoosista, mutta taudin vakavuus on erilainen. Tutkijat valitsevat MS-potilaita, jotka kattavat suurimman mahdollisen taudin vaikeusasteen spektrin keskuksen käyttämän EDSS-pistemäärän perusteella. Viimeisenä tavoitteena henkilöt, joilla on korkea uusiutumisriski, kutsutaan profilointiin 6 kuukauden välein, ja jos uusiutuminen tapahtuu, heidät profiloidaan heidän vierailunsa yhteydessä keskukseen sekä kuukauden kuluttua uusiutumistapahtumasta.
2. Kohorttiprofilointi. Jokaiselta potilaalta tutkijat saavat moniulotteisen tiedon MS-tietokannasta, joka koostuu tarvittaessa osajoukosta: (1) Kliiniset metatiedot, mukaan lukien: suostumuslomake; Lääkkeet; vuotuinen uusiutumisaste; (2) verikokeet, mukaan lukien täydellinen verenkuva, täydellinen biokemia, lipidiprofiili, kolesteroliprofiili; (3) täydellinen neurologinen tutkimus EDSS-pisteiden saamiseksi, kognitiivinen arviointi, kävelyarviointi; MRI-kuvaustiedot, herätetyt potentiaalit, hoitovaste; (4) Verinäytteet käsitellään proteiinin mRNA:n ilmentämistä varten ja perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) erotetaan Ficoll-Hypaque-gradientilla, kokonais-RNA puhdistetaan, leimataan, hybridisoidaan Genechip-taulukkoon (U133A2) ja skannataan (GeneArray-TM-skanneri). G2500A; Hewlett Packard) valmistajan protokollan mukaisesti (Affymetrix, Santa Clara, CA). MAS5-ohjelmistoa (Affymetrix) käytetään analysoimaan skannattuja taulukoita, jotka sisältävät ~22 000 geenitranskriptia, jotka vastaavat 14 500 hyvin merkittyä ihmisen geeniä. (5) Ulostenäytteistä saatu suoliston mikrobiotaprofiili käsitellään haulikkometagenomista sekvensointia ja 16S-rRNA-profilointia varten. Suoliston mikrobiotan profilointi tehdään ulostenäytteistä, jotka pakastetaan välittömästi nestetypessä ja säilytetään vähintään -80°C:ssa jatkokäsittelyyn asti. Näytteet käsitellään sitten automatisoidussa robottiputkistossa, joka on kehitetty Weizmannin Segal-laboratoriossa. Tämä putkisto toimii 96-kuoppaisessa muodossa ja voi erottaa DNA:ta 96 ulostenäytteestä yhden päivän kuluessa, valmistella DNA Illumina -kirjastoja haulikkometagenomista sekvensointia varten toisen päivän kuluessa ja suorittaa 16S rRNA -geenin multipleksoidun polymeraasiketjureaktion (PCR) monistamisen toisessa. päivä. Siten jokainen kerätty 96 ulostenäyteryhmä voidaan käsitellä robottisti sekä 16S- että metagenomista sekvensointia varten 3 päivän sisällä yhden laboratorioteknikon valvonnassa.
3. Tietojen analysointi ja algoritminen kehitys. (I) Mikrobiota: Tutkiakseen kattavasti mikrobiomin roolia MS-taudissa tutkijat menevät paljon pidemmälle kuin standardi 16S-rRNA-analyysi ja analysoivat koko haulikon metagenominäytteitä. Sekvensoimalla ulostenäytteiden koko DNA-sisältö, metagenomisekvensointi voi mahdollisesti antaa paljon enemmän tietoa verrattuna 16S:ään, koska sen avulla voidaan tutkia genomin rakennetta, rakenteellisia variantteja sekä geenien ja metabolisten reittien toimintoja. Otettuaan nämä piirteet mikrobiomista (katso alla alustavissa tuloksissa) tutkijat aloittavat käyttämällä perus yksimuuttuja- ja monimuuttujaassosiaatiotestejä ja jatkavat monimutkaisemmilla koneoppimismalleilla, jotka yrittävät erottaa MS-tautia sairastavat henkilöt, joilla ei ole mikrobiomiominaisuuksien perusteella. (tavoite 1), luokitella sairauden vakavuus (tavoite 2), ennustaa uusiutumisen riskiä (tavoite 3), erottaa MS-taudin fenotyypit eli radiologisesti eristetty oireyhtymä (RIS), kliinisesti eristetty oireyhtymä (CIS), relapsoiva-remittoiva MS (tavoite 3). RRMS), primaarisesti progressiivinen MS (PPMS) (tavoite 4) ja tunnistaa hoitoon reagoivat (tavoite 5). (II) Veri: Proteiinin ilmentymisen analysointi Partek Genomics Software (www.partek.com) käytetään.
4. Yksi- ja monimuuttuja-analyysit. Tutkijat laskevat ensin korrelaation (Pearson ja Spearman) kaikkien profiloitujen yksilöiden kaikkien mikrobiomiominaisuuksien ja eri potilasmittausten välillä (EDSS-pisteet, uusiutumisesta kulunut aika jne.) ja korjaavat suoritetut useat hypoteesit. Koska tutkijat tuottavat valtavan määrän mikrobiomiominaisuuksia ja monet niistä korreloivat voimakkaasti keskenään, tämä analyysi voi kärsiä tilastollisen tehon puutteesta, varsinkin kun otetaan huomioon, että osallistujien määrä on paljon pienempi kuin piirteiden lukumäärä. Tästä syystä tutkijat suorittavat myös monimuuttujaanalyysejä (esim. yksittäisarvon hajottelu, pääkomponenttianalyysi), koska näillä menetelmillä tunnistetut keskeiset komponentit tallentavat tiedon suurimman vaihtelun tavalla, joka ottaa huomioon sisäisen rakenteen ja niiden väliset suhteet. eri syöttöominaisuudet. Tämän jälkeen tutkijat testaavat, tarjoavatko jonkin tämän analyysin pääkomponentin tietojen ennusteet osallistujien merkittävän erottelun heidän mitattujen metabolisten parametrien perusteella. Erilaisena monimuuttuja-analyysinä tutkijat käyttävät myös erilaisia ​​valvomattomia klusterointimenetelmiä (esim. hierarkkista klusterointia, naiivia Bayesia) ryhmitelläkseen osallistujat heidän mikrobiomiominaisuuksiensa perusteella ja tutkiakseen sitten klusterien rikastumista normaaleissa tai epänormaaleissa aineenvaihdunnan parametreissa.

Koneoppimisalgoritmit. Globaalimpana lähestymistavana, jolla pyritään kvantifioimaan mikrobiomin kokonaisosuutta MS-tautiin ja selvittämään eri mikrobiomin ominaisuuksien suhteellinen osuus, tutkijat luokittelevat tutkimuksen osallistujat useisiin ryhmiin kussakin tavoitteessa (esim. tavoitteessa 1 potilaat vs. terveet). yksilöitä; tavoitteena 2 yksilöitä, joilla on korkea vs. alhainen EDSS-pistemäärä samana ajanjaksona MS-diagnoosista) ja kehittää erilaisia ​​laskentamenetelmiä (esim. tehostetut päätöspuut, tukivektorikonealgoritmit (SVM)) tähän luokitusongelmaan käyttämällä vain mikrobiomiominaisuuksia. luotu yllä. Tutkijat käyttävät ristiinvalidointijärjestelmää, jossa mallikoulutus tehdään satunnaisesti valitun osallistujien osajoukon tiedoilla ja testataan sitten jäljellä olevien osallistujien tiedoilla. Lisäksi tutkijat jättävät sivuun testisarjan, jossa tutkijat arvioivat lopullisen mallin, joka on johdettu ristiinvalidaatiossa, mikä mahdollistaa todellisen arvion malliemme suorituskyvystä. Koska mikrobiomien ominaisuuksien määrä ja siten myös dimensioiden määrä on suuri, tutkijat käyttävät erilaisia ​​piirteiden valintamenetelmiä keinona välttää liiallista sovitusta ja vähentää dimensiota. Segal-laboratorio (Weizmann) on ollut edelläkävijä useiden tällaisten menetelmien kehittämisessä samanlaisissa olosuhteissa geenisäätelyn alalla. Tutkijat käyttävät myös samanlaista järjestelmää ennustaakseen jatkuvaa EDSS-pistettä, joka edustaa MS-taudin vakavuutta. Ongelman kokoonpano on samanlainen kuin luokittelu, mutta menetelmäkehitys on aivan erilaista, koska luokittelumenetelmät korvataan regressiotyyppisillä menetelmillä (esim. lineaarinen regressio, todennäköisyysmallit, stokastinen gradienttilaskeutuminen).