破译肠道微生物群在多发性硬化症中的作用

方法和操作计划的描述

我们的研究计划包括以下步骤：

1. 队列组装。 对于上述每一个目标，研究人员将使用 Sheba 医疗中心的独特数据库来识别相关人员并邀请他们参与研究。 Achiron 教授在开展许多利用中心可用的独特患者数据库的研究项目方面拥有丰富的经验。 对于比较 MS 患者与健康个体的第一个目标，研究人员将选择性别、年龄和饮食匹配的健康个体，理想情况下选择 MS 患者的配偶作为健康对照，因为生活在相同环境中的个体具有更相似的微生物群。 在我们的第二个目标中，比较诊断时间相似但疾病严重程度不同的 MS 患者，研究人员将选择跨越尽可能大的疾病严重程度范围的 MS 患者，根据中心采用的 EDSS 评分进行判断。 为达到最终目标，将每 6 个月邀请复发风险高的个人进行分析，如果发生复发，将在他们访问中心时以及复发事件发生一个月后对他们进行分析。
2. 队列分析。 从每位患者身上，研究人员将从 MS 数据库中获取多维数据，酌情包括以下子集：(1) 临床元数据，包括：同意书；药物；年复发率； (2) 血液检查，包括全血细胞计数、完整生化、血脂谱、胆固醇谱； (3) 完成神经学检查以获得EDSS评分、认知评估、步态评估； MRI成像数据、诱发电位、治疗反应； (4) 血样将进行蛋白质 mRNA 表达处理，外周血单核细胞 (PBMC) 将在 Ficoll-Hypaque 梯度上分离，总 RNA 纯化，标记，与基因芯片阵列 (U133A2) 杂交，并扫描（GeneArray-TM 扫描仪G2500A；Hewlett Packard）根据制造商的协议（Affymetrix，Santa Clara，CA）。 MAS5 软件 (Affymetrix) 将用于分析包含约 22,000 个基因转录本的扫描阵列，对应于 14,500 个注释良好的人类基因。 (5) 从粪便样本中获得的肠道微生物群概况将被处理用于鸟枪法宏基因组测序和 16S rRNA 分析。 肠道微生物群分析将从粪便样本中完成，粪便样本将立即在液氮中快速冷冻并保存在最低 -80°C 直至进一步处理。 然后，样品将由魏茨曼西格尔实验室开发的自动化机器人管道进行处理。 该流水线以 96 孔形式工作，可在一天内从 96 个粪便样本中提取 DNA，在一天内制备用于鸟枪法宏基因组测序的 DNA Illumina 文库，在另一天进行 16S rRNA 基因的多重聚合酶链反应 (PCR) 扩增天。 因此，在一名实验室技术人员的监督下，可以在 3 天内对收集到的每 96 个粪便样本组进行机器人处理，以进行 16S 和宏基因组测序。
3. 数据分析和算法开发。 (I) 微生物群：为了全面研究微生物组在 MS 中的作用，研究人员将远远超出标准的 16S rRNA 分析，并进入对完整鸟枪法宏基因组样本的分析。 通过对粪便样本的全部 DNA 内容进行测序，与 16S 相比，宏基因组测序可能会提供更多信息，因为它可以研究基因组结构、结构变异以及基因和代谢途径功能。 从微生物组中提取这些特征后（见下文的初步结果），研究人员将首先采用基本的单变量和多变量关联测试，并继续使用更复杂的机器学习模型，这些模型试图根据微生物组特征将患有 MS 的个体与未患有 MS 的个体区分开来（目标 1），对疾病严重程度进行分类（目标 2），预测复发风险（目标 3），区分 MS 疾病表型，即放射学孤立综合征（RIS）、临床孤立综合征（CIS）、复发缓解型 MS（ RRMS）、原发性进行性 MS（PPMS）（目标 4），并确定治疗反应者（目标 5）。 (II) 血液：分析蛋白质表达 Partek Genomics Software (www.partek.com) 将会被使用。
4. 单变量和多变量分析。 研究人员将首先计算从所有个人资料中提取的所有微生物组特征与不同患者测量值（EDSS 评分、距复发时间等）之间的相关性（Pearson 和 Spearman），并校正所执行的多个假设。 由于研究人员将生成大量的微生物组特征，并且其中许多特征彼此高度相关，因此该分析可能缺乏统计能力，特别是考虑到参与者的数量将远小于特征的数量。 出于这个原因，研究人员还将进行多变量分析（例如，奇异值分解、主成分分析），因为这些方法识别的关键成分以考虑内部结构和关系的方式捕获数据的主要变化不同的输入特征。 然后，研究人员将测试该分析中任何主要成分的数据预测是否通过测量的代谢参数对参与者进行了显着隔离。 作为一种不同类型的多变量分析，研究人员还将采用不同的无监督聚类方法（例如，层次聚类、朴素贝叶斯）根据参与者的微生物组特征数据对参与者进行聚类，然后检查这些聚类是否富集了正常或异常的代谢参数。

机器学习算法。 作为一种旨在量化微生物组对 MS 的总体贡献并揭示不同微生物组特征的相对贡献的更全面的方法，研究人员将在每个目标中将研究参与者分为几个组（例如，目标 1 患者与健康人个体；目标是 2 个 EDSS 得分高与低的个体，在 MS 诊断的相似时间内），并开发不同的计算方法（例如，增强决策树、支持向量机算法 (SVM)）仅使用微生物组特征来解决此分类问题以上生成。 研究人员将使用交叉验证方案，即对随机选择的参与者子集的数据进行模型训练，然后对其余参与者的数据进行测试。 此外，研究人员将留下一个测试集，研究人员将在该测试集上评估在交叉验证中得出的最终模型，从而对我们模型的性能进行真实估计。 由于微生物组特征的数量和维度的数量很大，研究人员将采用各种特征选择方法作为避免过度拟合和降低维度的手段。 Segal 实验室 (Weizmann) 在基因调控领域的类似环境中率先开发了几种此类方法。 研究人员还将使用类似的方案来预测代表 MS 严重程度的连续 EDSS 评分。 问题设置类似于分类，但方法开发有很大不同，因为分类方法被回归类型的方法（例如，线性回归、概率模型、随机梯度下降）所取代。