Расшифровка роли микробиоты кишечника при рассеянном склерозе

Описание методов и план операции

План нашего исследования состоит из следующих этапов:

1. Сборка когорты. Для каждой из вышеперечисленных целей исследователи будут использовать уникальную базу данных Медицинского центра Шиба, чтобы идентифицировать соответствующих лиц и пригласить их принять участие в исследовании. Профессор Ачирон имеет большой опыт проведения многих исследовательских проектов с использованием уникальной базы данных пациентов, доступной Центру. Для первой цели, сравнивая пациентов с рассеянным склерозом со здоровыми людьми, исследователи будут выбирать здоровых людей, соответствующих полу, возрасту и диете, в идеале выбирая супругов пациентов с рассеянным склерозом в качестве здорового контроля, поскольку люди, живущие в той же среде, имеют более сходную микробиоту. В нашей второй цели, сравнивая пациентов с РС с одинаковым временем от постановки диагноза, но с разной тяжестью заболевания, исследователи выберут пациентов с РС, которые охватывают максимально возможный спектр тяжести заболевания, судя по шкале EDSS, используемой Центром. Для конечной цели лица с высоким риском рецидива будут приглашены для профилирования каждые 6 месяцев, и, если рецидив произойдет, они будут профилированы при посещении Центра, а также через один месяц после случая рецидива.
2. Когортное профилирование. От каждого пациента исследователи получат многомерные данные из базы данных MS, состоящие, в зависимости от обстоятельств, из подмножества: (1) клинических метаданных, включая: форму согласия; Лекарства; ежегодная частота рецидивов; (2) анализы крови, включая общий анализ крови, полную биохимию, липидный профиль, профиль холестерина; (3) Полное неврологическое обследование для получения оценки EDSS, когнитивной оценки, оценки походки; данные МРТ, вызванные потенциалы, ответ на лечение; (4) Образцы крови будут обработаны для экспрессии белковой мРНК, а мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) будут разделены в градиенте Ficoll-Hypaque, общая РНК очищена, помечена, гибридизирована с матрицей Genechip (U133A2) и отсканирована (сканер GeneArray-TM). G2500A; Hewlett Packard) в соответствии с протоколом производителя (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния). Программное обеспечение MAS5 (Affymetrix) будет использоваться для анализа отсканированных массивов, содержащих около 22 000 транскриптов генов, соответствующих 14 500 хорошо аннотированных генов человека. (5) Профиль кишечной микробиоты, полученный из образцов стула, будет обработан для метагеномного секвенирования дробовика и профилирования 16S рРНК. Профилирование кишечной микробиоты будет проводиться на основе образцов стула, которые будут немедленно подвергнуты мгновенной заморозке в жидком азоте и сохранены при температуре не ниже -80°C до дальнейшей обработки. Затем образцы будут обрабатываться автоматизированным роботизированным конвейером, разработанным в лаборатории Segal в Weizmann. Этот конвейер работает в 96-луночном формате и может извлекать ДНК из 96 образцов стула в течение одного дня, готовить библиотеки ДНК Illumina для метагеномного секвенирования дробовиком в течение еще одного дня и проводить амплификацию гена 16S рРНК с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в течение другого дня. день. Таким образом, каждая собранная группа образцов стула из 96 образцов может быть обработана роботом как для секвенирования 16S, так и для метагеномного секвенирования в течение 3 дней под наблюдением одного лаборанта.
3. Анализ данных и разработка алгоритмов. (I) Микробиота: чтобы всесторонне изучить роль микробиома при РС, исследователи выйдут далеко за рамки стандартного анализа 16S рРНК и займутся анализом полных образцов метагенома дробовика. Путем секвенирования всего содержимого ДНК образцов стула секвенирование метагенома потенциально может предоставить гораздо больше информации по сравнению с 16S, поскольку оно позволяет изучать структуру генома, структурные варианты, а также функции генов и метаболических путей. После извлечения этих признаков из микробиома (см. ниже в разделе «Предварительные результаты») исследователи начнут с использования базовых одномерных и многомерных ассоциативных тестов и продолжат работу с более сложными моделями машинного обучения, которые пытаются отличить людей с РС от людей без него на основе характеристик микробиома. (цель 1), классифицировать тяжесть заболевания (цель 2), прогнозировать риск рецидива (цель 3), дифференцировать фенотипы заболевания РС, т. е. рентгенологически изолированный синдром (РИС), клинически изолированный синдром (КИС), рецидивирующе-ремиттирующий РС ( RRMS), первично-прогрессирующий РС (PPMS) (цель 4) и выявить лиц, ответивших на лечение (цель 5). (II) Кровь: для анализа экспрессии белка Программное обеспечение Partek Genomics (www.partek.com) будет использован.
4. Одномерный и многомерный анализы. Исследователи сначала вычислят корреляцию (Пирсон и Спирмен) между всеми характеристиками микробиома, извлеченными для всех профилированных лиц, и различными измерениями пациентов (показатель EDSS, время до рецидива и т. д.) и скорректируют несколько выполненных гипотез. Поскольку исследователи будут генерировать огромное количество характеристик микробиома, и многие из них сильно коррелируют друг с другом, этот анализ может страдать от недостатка статистической мощности, особенно с учетом того, что количество участников будет намного меньше, чем количество признаков. По этой причине исследователи также будут выполнять многомерный анализ (например, разложение по сингулярным числам, анализ главных компонентов), поскольку ключевые компоненты, идентифицированные этими методами, фиксируют основные различия в данных таким образом, чтобы учитывать внутреннюю структуру и отношения между различные входные характеристики. Затем исследователи проверят, обеспечивают ли проекции данных по какому-либо из основных компонентов в этом анализе значительное разделение участников по их измеренным метаболическим параметрам. В качестве другого типа многомерного анализа исследователи также будут использовать различные неконтролируемые методы кластеризации (например, иерархическую кластеризацию, наивный байесовский метод), чтобы сгруппировать участников по их характеристикам микробиома, а затем изучить кластеры на предмет обогащения нормальными или аномальными метаболическими параметрами.

Алгоритмы машинного обучения. В качестве более глобального подхода, направленного на количественную оценку общего вклада микробиома в рассеянный склероз и выявление относительного вклада различных характеристик микробиома, исследователи будут классифицировать участников исследования на несколько групп по каждой цели (например, в цели 1 пациенты по сравнению со здоровыми). человек; в цели 2 человека с высоким или низким баллом EDSS за одинаковое время с момента постановки диагноза РС) и разработать различные вычислительные методы (например, форсированные деревья решений, алгоритмы машины опорных векторов (SVM)) для этой задачи классификации с использованием только признаков микробиома. сгенерировано выше. Исследователи будут использовать схему перекрестной проверки, в соответствии с которой обучение модели проводится на данных случайно выбранной подгруппы участников, а затем проверяется на данных оставшихся участников. Кроме того, исследователи оставят в стороне тестовый набор, на котором исследователи будут оценивать окончательную модель, полученную в результате перекрестной проверки, что позволит получить истинную оценку производительности наших моделей. Поскольку количество признаков микробиома и, следовательно, количество измерений велико, исследователи будут использовать различные подходы к выбору признаков, чтобы избежать переобучения и уменьшения размерности. Лаборатория Сигала (Weizmann) стала пионером в разработке нескольких таких методов в аналогичных условиях в области регуляции генов. Исследователи также будут использовать аналогичную схему для прогнозирования непрерывной оценки EDSS, отражающей тяжесть рассеянного склероза. Постановка проблемы аналогична классификации, но разработка метода сильно отличается, поскольку методы классификации заменяются методами регрессионного типа (например, линейная регрессия, вероятностные модели, стохастический градиентный спуск).