Dechiffrere rollen til tarmmikrobiotaen i multippel sklerose

Beskrivelse av metoder og operasjonsplan

Vår forskningsplan består av følgende trinn:

1. Kohortsamling. For hvert av målene ovenfor vil etterforskerne bruke den unike databasen til Sheba Medical Center for å identifisere de relevante personene og invitere dem til å delta i studien. Prof. Achiron har mye erfaring med å gjennomføre mange forskningsprosjekter som bruker den unike pasientdatabasen som er tilgjengelig for senteret. For det første målet å sammenligne MS-pasienter med friske individer vil etterforskerne velge kjønns-, alders- og dietttilpassede friske individer, og ideelt sett velge ektefeller til MS-pasienter som sunne kontroller ettersom individer som bor i samme miljø har mer lik mikrobiota. I vårt andre mål med å sammenligne MS-pasienter med lignende tid fra diagnose, men forskjellig sykdomsgrad, vil etterforskerne velge MS-pasienter som spenner over det størst mulige spekteret av sykdommens alvorlighetsgrad, bedømt av EDSS-skåren brukt av senteret. For det endelige målet vil personer med høy risiko for tilbakefall bli invitert til profilering hver 6. måned, og hvis tilbakefall oppstår, vil de bli profilert ved besøket til senteret samt en måned etter tilbakefallshendelsen.
2. Kohortprofilering. Fra hver pasient vil etterforskerne innhente flerdimensjonale data fra MS-databasen, som, etter behov, består av en undergruppe av: (1) Kliniske metadata, inkludert: Samtykkeskjema; Medisiner; årlig tilbakefallsrate; (2) Blodprøver, inkludert en fullstendig blodtelling, fullstendig biokjemi, lipidprofil, kolesterolprofil; (3) Fullstendig nevrologisk undersøkelse for å oppnå en EDSS-score, kognitiv vurdering, gangvurdering; MR-bildedata, fremkalte potensialer, behandlingsrespons; (4) Blodprøver vil bli behandlet for protein-mRNA-ekspresjon og perifert blod mononukleære celler (PBMCs) vil bli separert på Ficoll-Hypaque-gradient, totalt RNA renset, merket, hybridisert til Genechip-array (U133A2) og skannet (GeneArray-TM-skanner G2500A; Hewlett Packard) i henhold til produsentens protokoll (Affymetrix, Santa Clara, CA). MAS5-programvare (Affymetrix) vil bli brukt til å analysere de skannede arrayene som inneholder ~22 000 gentranskripsjoner tilsvarende 14 500 godt kommenterte menneskelige gener. (5) Tarmmikrobiotaprofil oppnådd fra avføringsprøver vil bli behandlet for metagenomisk sekvensering av hagle og 16S rRNA-profilering. Tarmmikrobiotaprofilering vil bli gjort fra avføringsprøver som umiddelbart vil bli hurtigfryst i flytende nitrogen og konservert ved minimum -80°C inntil videre behandling. Prøver vil deretter bli behandlet av en automatisert robotrørledning som ble utviklet i Segal-laboratoriet på Weizmann. Denne rørledningen fungerer i 96-brønns format og kan trekke ut DNA fra 96 ​​avføringsprøver i løpet av én dag, klargjøre DNA Illumina-biblioteker for hagle metagenomisk sekvensering innen en annen dag, og utføre multiplekset polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon av 16S rRNA-genet i en annen dag. dag. Dermed kan hver 96-krakkprøvegruppe som samles inn, behandles robotisk for både 16S og metagenomisk sekvensering innen 3 dager under tilsyn av en laboratorietekniker.
3. Dataanalyse og algoritmisk utvikling. (I) Mikrobiota: For å studere mikrobiomets rolle i MS, vil etterforskerne gå mye utover standard 16S rRNA-analyse og analysere full hagle metagenomprøver. Ved å sekvensere hele DNA-innholdet i avføringsprøver, kan metagenomsekvensering potensielt gi mye mer informasjon sammenlignet med 16S, da det gjør det mulig å studere genomstruktur, strukturelle varianter og gen- og metabolske veifunksjoner. Etter å ha ekstrahert disse funksjonene fra mikrobiomet (se nedenfor i foreløpige resultater), vil etterforskerne starte med å bruke grunnleggende univariate og multivariate assosiasjonstester, og fortsette med mer komplekse maskinlæringsmodeller som forsøker å skille individer med MS fra de uten basert på mikrobiomfunksjoner (mål 1), å klassifisere sykdommens alvorlighetsgrad (mål 2), å forutsi risiko for tilbakefall (mål 3), å skille mellom MS sykdomsfenotyper, dvs. radiologisk isolert syndrom (RIS), klinisk isolert syndrom (CIS), residiverende-remitterende MS ( RRMS), primær-progressiv MS (PPMS), (mål 4), og for å identifisere behandlingsrespondere (mål 5). (II) Blod: For å analysere proteinuttrykk Partek Genomics Software (www.partek.com) vil bli brukt.
4. Univariate og multivariate analyser. Etterforskerne vil først beregne korrelasjonen (Pearson og Spearman) mellom alle mikrobiomtrekk som er hentet ut på tvers av alle profilerte individer og de forskjellige pasientmålingene (EDSS-score, tid fra tilbakefall, etc.), og korrigere for de mange hypotesene som er utført. Siden etterforskerne vil generere et stort antall mikrobiomfunksjoner og mange av dem er sterkt korrelert til hverandre, kan denne analysen lide av mangel på statistisk kraft, spesielt gitt at antall deltakere vil være langt mindre enn antall funksjoner. Av denne grunn vil etterforskerne også utføre multivariate analyser (f.eks. singular verdidekomponering, hovedkomponentanalyse) siden nøkkelkomponentene identifisert av disse metodene fanger opp hovedvariasjonen i dataene på en måte som tar hensyn til den interne strukturen og relasjonene mellom de forskjellige inngangsfunksjonene. Etterforskerne vil deretter teste om projeksjoner av dataene fra noen av hovedkomponentene i denne analysen gir en betydelig segregering av deltakerne etter deres målte metabolske parametere. Som en annen type multivariat analyse, vil etterforskerne også bruke forskjellige uovervåkede klyngingsmetoder (f.eks. hierarkisk klynging, naive Bayes) for å klynge deltakerne etter deres mikrobiomfunksjonsdata, og deretter undersøke klyngene for berikelse i normale eller unormale metabolske parametere.

Maskinlæringsalgoritmer. Som en mer global tilnærming rettet mot å kvantifisere det totale bidraget fra mikrobiomet til MS og å avdekke det relative bidraget til de forskjellige mikrobiomets funksjoner, vil etterforskerne klassifisere studiedeltakerne i flere grupper i hvert mål (f.eks. i mål 1 pasienter versus friske individer; i mål 2 individer med høy versus lav EDSS-score for samme tid fra MS-diagnose), og utvikle forskjellige beregningsmetoder (f.eks. forsterkede beslutningstrær, Support Vector Machine-algoritmer (SVMs)) for dette klassifiseringsproblemet ved bruk av bare mikrobiomfunksjonene generert ovenfor. Etterforskerne vil bruke et kryssvalideringsskjema, der modelltreningen gjøres på dataene til en tilfeldig valgt undergruppe av deltakere og deretter testes på dataene til de gjenværende holdt ut deltakerne. I tillegg vil etterforskerne legge til side et testsett der etterforskerne vil evaluere den endelige modellen som er utledet i kryssvalidering, noe som gir et sant estimat av ytelsen til modellene våre. Ettersom antallet mikrobiomfunksjoner og dermed antall dimensjoner er stort, vil etterforskerne bruke ulike funksjonsvalgtilnærminger for å unngå overtilpasning og redusere dimensjonalitet. Segal-laboratoriet (Weizmann) har vært banebrytende i utviklingen av flere slike metoder i lignende omgivelser innen genregulering. Etterforskerne vil også bruke et lignende opplegg for å forutsi den kontinuerlige EDSS-skåren som representerer MS-alvorlighet. Problemoppsettet er likt klassifisering, men metodeutviklingen er ganske annerledes da klassifiseringsmetodene er erstattet med regresjonstype metoder (f.eks. lineær regresjon, sannsynlighetsmodeller, stokastisk gradientnedstigning).