Rozszyfrowanie roli mikroflory jelitowej w stwardnieniu rozsianym

Opis metod i plan działania

Nasz plan badawczy składa się z następujących kroków:

1. Zgromadzenie kohortowe. W każdym z powyższych celów badacze wykorzystają unikalną bazę danych Centrum Medycznego Sheba w celu zidentyfikowania odpowiednich osób i zaproszenia ich do udziału w badaniu. Prof. Achiron ma duże doświadczenie w prowadzeniu wielu projektów badawczych wykorzystujących dostępną w Centrum unikalną bazę danych pacjentów. W pierwszym celu, porównując pacjentów z SM z osobami zdrowymi, badacze wybiorą zdrowe osoby dopasowane pod względem płci, wieku i diety, najlepiej wybierając małżonków pacjentów ze stwardnieniem rozsianym jako zdrowych osób kontrolnych, ponieważ osoby żyjące w tym samym środowisku mają bardziej podobną mikroflorę. W naszym drugim celu, porównując pacjentów ze stwardnieniem rozsianym z podobnym czasem od diagnozy, ale różnym stopniem nasilenia choroby, badacze wybiorą pacjentów z SM, którzy obejmują największe możliwe spektrum ciężkości choroby, oceniane na podstawie wyniku EDSS stosowanego przez Centrum. W tym celu osoby z grupy wysokiego ryzyka nawrotu będą zapraszane do profilowania co 6 miesięcy, aw przypadku nawrotu będą one profilowane podczas wizyty w Centrum oraz miesiąc po nawrocie.
2. Profilowanie kohortowe. Od każdego pacjenta badacze uzyskają wielowymiarowe dane z bazy danych MS, składające się odpowiednio z podzbioru: (1) metadanych klinicznych, w tym: formularza zgody; leki; roczny wskaźnik nawrotów; (2) Badania krwi, w tym pełną morfologię krwi, pełną biochemię, profil lipidowy, profil cholesterolowy; (3) Pełne badanie neurologiczne w celu uzyskania wyniku EDSS, ocena funkcji poznawczych, ocena chodu; dane z obrazowania MRI, potencjały wywołane, odpowiedź na leczenie; (4) Próbki krwi zostaną przetworzone pod kątem ekspresji mRNA białka, a jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) zostaną rozdzielone w gradiencie Ficoll-Hypaque, oczyszczone całkowite RNA, znakowane, hybrydyzowane z macierzą Genechip (U133A2) i zeskanowane (skaner GeneArray-TM G2500A; Hewlett Packard) zgodnie z protokołem producenta (Affymetrix, Santa Clara, CA). Oprogramowanie MAS5 (Affymetrix) zostanie użyte do analizy zeskanowanych macierzy zawierających około 22 000 transkryptów genów odpowiadających 14 500 dobrze opisanym ludzkim genom. (5) Profil mikroflory jelitowej uzyskany z próbek kału zostanie przetworzony w celu sekwencjonowania metagenomicznego strzelby i profilowania 16S rRNA. Profilowanie mikroflory jelitowej zostanie przeprowadzone na podstawie próbek kału, które zostaną natychmiast szybko zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze co najmniej -80°C do czasu dalszego przetwarzania. Próbki będą następnie przetwarzane przez zautomatyzowany rurociąg, który został opracowany w laboratorium Segal w Weizmann. Rurociąg ten działa w formacie 96-dołkowym i może wyodrębnić DNA z 96 próbek kału w ciągu jednego dnia, przygotować biblioteki DNA Illumina do sekwencjonowania metagenomicznego shotgun w ciągu kolejnego dnia i przeprowadzić multipleksowaną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) amplifikacji genu 16S rRNA w innym dzień. W ten sposób każda zebrana grupa próbek 96-stolca może zostać przetworzona automatycznie w celu sekwencjonowania 16S i metagenomicznego w ciągu 3 dni pod nadzorem jednego technika laboratoryjnego.
3. Analiza danych i rozwój algorytmiczny. (I) Mikrobiota: Aby kompleksowo zbadać rolę mikrobiomu w SM, badacze wykroczą znacznie poza standardową analizę 16S rRNA i zajmą się analizą pełnych próbek metagenomu strzelby. Poprzez sekwencjonowanie całej zawartości DNA w próbkach kału, sekwencjonowanie metagenomu może potencjalnie dostarczyć znacznie więcej informacji w porównaniu z 16S, ponieważ pozwala badać strukturę genomu, warianty strukturalne oraz funkcje genów i szlaków metabolicznych. Po wydobyciu tych cech z mikrobiomu (patrz poniżej w Wstępnych wynikach), badacze rozpoczną od zastosowania podstawowych jedno- i wielowymiarowych testów asocjacyjnych i będą kontynuować bardziej złożone modele uczenia maszynowego, które próbują odróżnić osoby ze stwardnieniem rozsianym od tych bez cech mikrobiomu (cel 1), klasyfikowanie stopnia zaawansowania choroby (cel 2), przewidywanie ryzyka nawrotu (cel 3), różnicowanie fenotypów choroby tj. zespół izolowany radiologicznie (RIS), zespół izolowany klinicznie (CIS), rzutowo-remisyjne SM ( RRMS), pierwotnie postępujące SM (PPMS) (cel 4) oraz identyfikacja osób odpowiadających na leczenie (cel 5). (II) Krew: Analiza ekspresji białek Partek Genomics Software (www.partek.com) będzie użyty.
4. Analizy jednowymiarowe i wielowymiarowe. Badacze najpierw obliczą korelację (Pearson i Spearman) między wszystkimi cechami mikrobiomu wyodrębnionymi dla wszystkich profilowanych osób i różnymi pomiarami pacjenta (wynik EDSS, czas od nawrotu itp.) i skorygują wiele postawionych hipotez. Ponieważ badacze wygenerują ogromną liczbę cech mikrobiomu, a wiele z nich jest ze sobą silnie skorelowanych, analiza ta może cierpieć na brak mocy statystycznej, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że liczba uczestników będzie znacznie mniejsza niż liczba cech. Z tego powodu badacze przeprowadzą również analizy wielowymiarowe (np. dekompozycję wartości osobliwych, analizę głównych składowych), ponieważ kluczowe składowe zidentyfikowane za pomocą tych metod wychwytują główne zróżnicowanie danych w sposób uwzględniający wewnętrzną strukturę i relacje między różne funkcje wejściowe. Następnie badacze sprawdzą, czy prognozy danych według któregokolwiek z głównych głównych składników tej analizy zapewniają znaczącą segregację uczestników według ich zmierzonych parametrów metabolicznych. Jako inny rodzaj analizy wielowymiarowej, badacze zastosują również różne nienadzorowane metody grupowania (np. grupowanie hierarchiczne, naiwny Bayes), aby grupować uczestników według ich danych dotyczących cech mikrobiomu, a następnie badać klastry pod kątem wzbogacenia w normalne lub nieprawidłowe parametry metaboliczne.

Algorytmy uczenia maszynowego. W ramach bardziej globalnego podejścia, którego celem jest ilościowe określenie ogólnego wkładu mikrobiomu w stwardnienie rozsiane i rozwikłanie względnego udziału różnych cech mikrobiomu, badacze podzielą uczestników badania na kilka grup w każdym celu (np. osób; w celu 2 osoby z wysokim i niskim wynikiem EDSS w podobnym czasie od diagnozy SM) i opracować różne metody obliczeniowe (np. wygenerowane powyżej. Badacze zastosują schemat walidacji krzyżowej, w ramach którego szkolenie modelowe odbywa się na danych losowo wybranej podgrupy uczestników, a następnie jest testowane na danych pozostałych uczestników, którzy wstrzymali się. Ponadto badacze pozostawią zestaw testów, na podstawie którego badacze ocenią ostateczny model uzyskany w walidacji krzyżowej, co pozwoli na prawdziwe oszacowanie wydajności naszych modeli. Ponieważ liczba cech mikrobiomu, a tym samym liczba wymiarów, jest duża, badacze zastosują różne podejścia do selekcji cech, aby uniknąć nadmiernego dopasowania i zmniejszenia wymiarowości. Laboratorium Segal (Weizmann) było pionierem w opracowaniu kilku takich metod w podobnych warunkach w obszarze regulacji genów. Badacze wykorzystają również podobny schemat do przewidywania ciągłego wyniku EDSS reprezentującego ciężkość SM. Konfiguracja problemu jest podobna do klasyfikacji, ale rozwój metody jest zupełnie inny, ponieważ metody klasyfikacji są zastępowane metodami typu regresji (np. Regresja liniowa, modele probabilistyczne, stochastyczny spadek gradientu).