Rozluštění role střevní mikrobioty u roztroušené sklerózy

Popis metod a plánu provozu

Náš výzkumný plán se skládá z následujících kroků:

1. Sestavení kohorty. Pro každý z výše uvedených cílů využijí vyšetřovatelé jedinečnou databázi Sheba Medical Center k identifikaci příslušných jednotlivců a pozvou je k účasti na studii. Prof. Achiron má mnoho zkušeností s prováděním mnoha výzkumných projektů, které využívají jedinečnou databázi pacientů dostupnou Centru. Pro první cíl srovnání pacientů s RS se zdravými jedinci výzkumníci vyberou zdravé jedince odpovídající pohlaví, věku a stravě, v ideálním případě vyberou manžele pacientů s RS jako zdravé kontroly, protože jedinci žijící ve stejném prostředí mají podobnější mikrobiotu. V našem druhém cíli porovnat pacienty s RS s podobnou dobou od diagnózy, ale různou závažností onemocnění, výzkumníci vyberou pacienty s RS, kteří pokrývají největší možné spektrum závažnosti onemocnění, jak je posouzeno podle skóre EDSS používaného Centrem. Pro konečný cíl budou jedinci s vysokým rizikem relapsu pozváni k profilování každých 6 měsíců, a pokud dojde k relapsu, budou profilováni při návštěvě Centra a také jeden měsíc po události relapsu.
2. Profilování kohorty. Od každého pacienta vyšetřovatelé získají multidimenzionální data z databáze RS sestávající, pokud je to vhodné, z podmnožiny: (1) klinických metadat, včetně: formuláře souhlasu; Léky; roční míra relapsů; (2) Krevní testy, včetně kompletního krevního obrazu, kompletní biochemie, lipidového profilu, cholesterolu; (3) Kompletní neurologické vyšetření pro získání skóre EDSS, kognitivní hodnocení, hodnocení chůze; Zobrazovací data MRI, evokované potenciály, odpověď na léčbu; (4) Vzorky krve budou zpracovány pro expresi proteinové mRNA a mononukleární buňky periferní krve (PBMC) budou separovány na Ficoll-Hypaque gradientu, celková RNA purifikována, značena, hybridizována na Genechip array (U133A2) a skenována (GeneArray-TM skener G2500A; Hewlett Packard) podle protokolu výrobce (Affymetrix, Santa Clara, CA). Software MAS5 (Affymetrix) bude použit k analýze naskenovaných čipů obsahujících ~22 000 genových transkriptů odpovídajících 14 500 dobře anotovaných lidských genů. (5) Profil střevní mikroflóry získaný ze vzorků stolice bude zpracován pro brokovnicové metagenomické sekvenování a profilování 16S rRNA. Profilování střevní mikroflóry bude provedeno ze vzorků stolice, které budou ihned bleskově zmraženy v tekutém dusíku a uchovány při minimálně -80°C do dalšího zpracování. Vzorky pak budou zpracovány automatizovaným robotickým potrubím, které bylo vyvinuto v laboratoři Segal ve Weizmannu. Toto potrubí funguje v 96jamkovém formátu a může během jednoho dne extrahovat DNA z 96 vzorků stolice, během dalšího dne připravit knihovny DNA Illumina pro metagenomické sekvenování pomocí brokovnice a v jiném dni provádět amplifikaci genu 16S rRNA pomocí multiplexní polymerázové řetězové reakce (PCR). den. Každá odebraná skupina vzorků s 96 stolicemi tak může být roboticky zpracována pro 16S i metagenomické sekvenování do 3 dnů pod dohledem jednoho laboratorního technika.
3. Analýza dat a vývoj algoritmů. (I) Mikrobiota: Aby bylo možné komplexně prostudovat roli mikrobiomu u RS, vědci půjdou mnohem nad rámec standardní analýzy 16S rRNA a do analýzy vzorků metagenomu s úplnou brokovnicí. Sekvenováním celého obsahu DNA ve vzorcích stolice může sekvenování metagenomu potenciálně poskytnout mnohem více informací ve srovnání s 16S, protože umožňuje studovat strukturu genomu, strukturální varianty a funkce genů a metabolických drah. Po extrakci těchto vlastností z mikrobiomu (viz níže v Předběžných výsledcích) začnou výzkumníci s použitím základních jednorozměrných a vícerozměrných asociačních testů a budou pokračovat se složitějšími modely strojového učení, které se pokoušejí odlišit jedince s RS od jedinců bez na základě vlastností mikrobiomu. (cíl 1), klasifikovat závažnost onemocnění (cíl 2), předpovídat riziko relapsu (cíl 3), rozlišit mezi fenotypy onemocnění RS, tj. radiologicky izolovaný syndrom (RIS), klinicky izolovaný syndrom (CIS), relaps-remitující RS ( RRMS), primárně progresivní RS (PPMS), (cíl 4), a identifikovat osoby reagující na léčbu (cíl 5). (II) Krev: Analýza proteinové exprese Partek Genomics Software (www.partek.com) bude použito.
4. Jednorozměrné a vícerozměrné analýzy. Vyšetřovatelé nejprve spočítají korelaci (Pearson a Spearman) mezi všemi rysy mikrobiomu extrahovanými napříč všemi profilovanými jedinci a různými měřeními pacientů (skóre EDSS, doba od relapsu atd.) a korigují pro více provedených hypotéz. Vzhledem k tomu, že vyšetřovatelé vygenerují obrovské množství mikrobiomových rysů a mnohé z nich spolu vysoce korelují, může tato analýza trpět nedostatkem statistické síly, zejména vzhledem k tomu, že počet účastníků bude mnohem menší než počet rysů. Z tohoto důvodu budou vyšetřovatelé také provádět vícerozměrné analýzy (např. dekompozice singulární hodnoty, analýza hlavních komponent), protože klíčové komponenty identifikované těmito metodami zachycují hlavní variace v datech způsobem, který bere v úvahu vnitřní strukturu a vztahy mezi různé vstupní funkce. Vyšetřovatelé pak otestují, zda projekce dat některou z hlavních hlavních složek v této analýze poskytuje významnou segregaci účastníků podle jejich naměřených metabolických parametrů. Jako jiný typ vícerozměrné analýzy budou vyšetřovatelé také používat různé metody shlukování bez dozoru (např. hierarchické shlukování, naivní Bayes) k seskupení účastníků podle jejich údajů o vlastnostech mikrobiomu a poté zkoumat shluky na obohacení o normální nebo abnormální metabolické parametry.

Algoritmy strojového učení. Jako globálnější přístup zaměřený na kvantifikaci celkového příspěvku mikrobiomu k RS a na odhalení relativního příspěvku různých rysů mikrobiomu, výzkumníci klasifikují účastníky studie do několika skupin v každém cíli (např. v cíli 1 pacienti versus zdraví jednotlivci; v cíli 2 jedinci s vysokým versus nízkým skóre EDSS po podobnou dobu od diagnózy RS) a vyvinout různé výpočetní metody (např. posílené rozhodovací stromy, algoritmy podpůrného vektorového stroje (SVM)) pro tento klasifikační problém s použitím pouze funkcí mikrobiomu vygenerované výše. Vyšetřovatelé použijí schéma křížové validace, kdy se modelový trénink provádí na datech náhodně vybrané podskupiny účastníků a poté se testuje na datech zbývajících účastníků. Kromě toho vyšetřovatelé ponechají stranou testovací sadu, na které vyšetřovatelé vyhodnotí konečný model, který je odvozen v křížové validaci, což umožní skutečný odhad výkonu našich modelů. Vzhledem k tomu, že počet znaků mikrobiomu a tím i počet rozměrů je velký, výzkumníci použijí různé přístupy k výběru znaků, aby se vyhnuli nadměrnému přizpůsobení a snížení rozměrů. Laboratoř Segal (Weizmann) byla průkopníkem vývoje několika takových metod v podobném prostředí v oblasti genové regulace. Výzkumníci také použijí podobné schéma k predikci kontinuálního skóre EDSS představujícího závažnost RS. Nastavení problému je podobné klasifikaci, ale vývoj metody je zcela odlišný, protože klasifikační metody jsou nahrazeny metodami regresního typu (např. lineární regrese, pravděpodobnostní modely, sestup stochastického gradientu).