Dechiffrera rollen av tarmmikrobiotan i multipel skleros

Beskrivning av metoder och verksamhetsplan

Vår forskningsplan består av följande steg:

1. Kohortsamling. För vart och ett av ovanstående syften kommer utredarna att använda Sheba Medical Centers unika databas för att identifiera relevanta individer och bjuda in dem att delta i studien. Prof. Achiron har lång erfarenhet av att genomföra många forskningsprojekt som använder den unika patientdatabasen som finns tillgänglig för centret. För det första målet att jämföra MS-patienter med friska individer kommer forskarna att välja köns-, ålders- och kostmatchade friska individer, och idealiskt välja makar till MS-patienter som friska kontroller eftersom individer som lever i samma miljö har mer liknande mikrobiota. I vårt andra syfte att jämföra MS-patienter med liknande tid från diagnos men olika svårighetsgrad, kommer utredarna att välja MS-patienter som spänner över det största möjliga spektrumet av sjukdomens svårighetsgrad enligt EDSS-poängen som används av centret. För det slutliga målet kommer individer med hög risk för återfall att bjudas in till profilering var sjätte månad och om återfall inträffar kommer de att profileras vid deras besök på centret samt en månad efter återfallshändelsen.
2. Kohortprofilering. Från varje patient kommer utredarna att erhålla flerdimensionell data från MS-databasen som, i förekommande fall, består av en undergrupp av: (1) Klinisk metadata, inklusive: Samtyckesformulär; Mediciner; årlig återfallsfrekvens; (2) Blodprov, inklusive ett fullständigt blodvärde, fullständig biokemi, lipidprofil, kolesterolprofil; (3) Fullständig neurologisk undersökning för att erhålla en EDSS-poäng, kognitiv bedömning, gångbedömning; MRT-avbildningsdata, framkallade potentialer, behandlingssvar; (4) Blodprover kommer att bearbetas för protein-mRNA-uttryck och perifera mononukleära blodceller (PBMC) kommer att separeras på Ficoll-Hypaque-gradient, totalt RNA renas, märkas, hybridiseras till Genechip-array (U133A2) och skannas (GeneArray-TM-skanner G2500A; Hewlett Packard) enligt tillverkarens protokoll (Affymetrix, Santa Clara, CA). MAS5-mjukvara (Affymetrix) kommer att användas för att analysera de skannade arrayerna som innehåller ~22 000 gentranskript motsvarande 14 500 välkommenterade mänskliga gener. (5) Tarmmikrobiotaprofil erhållen från avföringsprover kommer att bearbetas för hagelgevärs metagenomisk sekvensering och 16S rRNA-profilering. Profilering av tarmmikrobiota kommer att göras från avföringsprover som omedelbart snabbfrysas i flytande kväve och bevaras vid minst -80°C tills vidare bearbetning. Proverna kommer sedan att behandlas av en automatiserad robotpipeline som utvecklades i Segal-labbet vid Weizmann. Denna pipeline fungerar i 96-brunnars format och kan extrahera DNA från 96 avföringsprov inom en dag, förbereda DNA Illumina-bibliotek för hagelgevärs metagenomisk sekvensering inom en annan dag och utföra multiplexerad polymeraskedjereaktion (PCR) amplifiering av 16S rRNA-genen i en annan dag. Således kan varje provgrupp med 96 avföring som samlas in bearbetas robotiskt för både 16S och metagenomisk sekvensering inom 3 dagar under överinseende av en labbtekniker.
3. Dataanalys och algoritmisk utveckling. (I) Mikrobiota: För att heltäckande studera mikrobiomets roll i MS, kommer utredarna att gå mycket längre än standard 16S rRNA-analys och in i analys av full shotgun-metagenomprover. Genom att sekvensera hela DNA-innehållet i avföringsprover kan metagenomsekvensering potentiellt ge mycket mer information jämfört med 16S, eftersom det gör det möjligt att studera genomstruktur, strukturella varianter och gen- och metaboliska vägfunktioner. Efter att ha extraherat dessa egenskaper från mikrobiomet (se nedan i preliminära resultat), kommer utredarna att börja med att använda grundläggande univariata och multivariata associationstester, och fortsätta med mer komplexa maskininlärningsmodeller som försöker skilja individer med MS från de utan baserade på mikrobiomfunktioner (mål 1), att klassificera sjukdomens svårighetsgrad (mål 2), för att förutsäga återfallsrisk (mål 3), att skilja mellan MS-sjukdomsfenotyper, dvs radiologiskt isolerat syndrom (RIS), kliniskt isolerat syndrom (CIS), skov-remitterande MS ( RRMS), primär-progressiv MS (PPMS), (mål 4) och för att identifiera behandlingssvarare (mål 5). (II) Blod: För att analysera proteinuttryck Partek Genomics Software (www.partek.com) kommer att användas.
4. Univariata och multivariata analyser. Utredarna kommer först att beräkna korrelationen (Pearson och Spearman) mellan alla mikrobiomfunktioner som extraherats över alla profilerade individer och de olika patientmåtten (EDSS-poäng, tid från återfall, etc.), och korrigera för de multipla hypoteser som utförts. Eftersom utredarna kommer att generera ett stort antal mikrobiomer och många av dem är starkt korrelerade till varandra, kan denna analys lida av brist på statistisk kraft, särskilt med tanke på att antalet deltagare kommer att vara mycket mindre än antalet funktioner. Av denna anledning kommer utredarna också att utföra multivariata analyser (t.ex. singularvärdesuppdelning, principalkomponentanalys) eftersom nyckelkomponenterna som identifieras av dessa metoder fångar huvudvariationen i data på ett sätt som tar hänsyn till den interna strukturen och relationerna mellan de olika inmatningsfunktionerna. Utredarna kommer sedan att testa om projektioner av data från någon av huvudkomponenterna i denna analys ger en signifikant segregering av deltagarna genom deras uppmätta metabola parametrar. Som en annan typ av multivariat analys kommer utredarna också att använda olika oövervakade klustringsmetoder (t.ex. hierarkisk klustring, naiva Bayes) för att klustera deltagarna efter deras mikrobiomfunktionsdata och sedan undersöka klustren för anrikning av normala eller onormala metabola parametrar.

Maskininlärningsalgoritmer. Som ett mer globalt tillvägagångssätt som syftar till att kvantifiera det övergripande bidraget från mikrobiomen till MS och att reda ut det relativa bidraget från de olika mikrobiomens egenskaper, kommer utredarna att klassificera studiedeltagarna i flera grupper i varje mål (t.ex. i mål 1-patienter kontra friska individer; i mål 2 individer med högt kontra lågt EDSS-poäng under samma tid från MS-diagnos), och utveckla olika beräkningsmetoder (t.ex. förstärkta beslutsträd, Support Vector Machine-algoritmer (SVM)) för detta klassificeringsproblem med enbart mikrobiomfunktionerna genererade ovan. Utredarna kommer att använda ett korsvalideringsschema, där modellträningen görs på data från en slumpmässigt vald delmängd av deltagare och sedan testas på data från de återstående uthållna deltagarna. Dessutom kommer utredarna att lämna ett testset åt sidan där utredarna kommer att utvärdera den slutliga modellen som härleds i korsvalidering, vilket möjliggör en sann uppskattning av prestandan hos våra modeller. Eftersom antalet mikrobiomfunktioner och därmed antalet dimensioner är stort, kommer utredarna att använda olika tillvägagångssätt för val av egenskaper för att undvika överanpassning och minska dimensionalitet. Segal-labbet (Weizmann) har banat väg för utvecklingen av flera sådana metoder i liknande miljöer inom området genreglering. Utredarna kommer också att använda ett liknande schema för att förutsäga den kontinuerliga EDSS-poängen som representerar MS svårighetsgrad. Problemuppställningen liknar klassificering, men metodutvecklingen är ganska annorlunda då klassificeringsmetoderna ersätts med metoder av regressionstyp (t.ex. linjär regression, probabilistiska modeller, stokastisk gradientnedstigning).