Descifrando el papel de la microbiota intestinal en la esclerosis múltiple

Descripción de métodos y plan de operación

Nuestro plan de investigación consta de los siguientes pasos:

1. Asamblea de la cohorte. Para cada uno de los objetivos anteriores, los investigadores utilizarán la base de datos única del Centro Médico Sheba para identificar a las personas relevantes e invitarlas a participar en el estudio. El Prof. Achiron tiene mucha experiencia en la realización de muchos proyectos de investigación que utilizan la base de datos de pacientes única disponible para el Centro. Para el primer objetivo, comparar pacientes con EM con individuos sanos, los investigadores seleccionarán individuos sanos del mismo sexo, edad y dieta, idealmente seleccionando cónyuges de pacientes con EM como controles sanos, ya que las personas que viven en el mismo entorno tienen una microbiota más similar. En nuestro segundo objetivo, comparar pacientes con EM con un tiempo similar desde el diagnóstico pero diferente gravedad de la enfermedad, los investigadores seleccionarán pacientes con EM que abarquen el mayor espectro posible de gravedad de la enfermedad a juzgar por la puntuación EDSS empleada por el Centro. Para el objetivo final, se invitará a las personas con alto riesgo de recaída a que se perfilen cada 6 meses y, si se produce una recaída, se perfilarán en su visita al Centro, así como un mes después del evento de recaída.
2. Perfilado de cohortes. De cada paciente, los investigadores obtendrán datos multidimensionales de la base de datos de EM que consisten, según corresponda, en un subconjunto de: (1) Metadatos clínicos, que incluyen: formulario de consentimiento; medicamentos; tasa de recaída anual; (2) Exámenes de sangre, incluyendo hemograma completo, bioquímica completa, perfil de lípidos, perfil de colesterol; (3) Examen neurológico completo para obtener una puntuación EDSS, evaluación cognitiva, evaluación de la marcha; datos de imágenes de resonancia magnética, potenciales evocados, respuesta al tratamiento; (4) Las muestras de sangre se procesarán para la expresión de ARNm de proteína y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separarán en un gradiente de Ficoll-Hypaque, se purificará el ARN total, se etiquetará, se hibridará con la matriz Genechip (U133A2) y se escaneará (escáner GeneArray-TM G2500A; Hewlett Packard) según el protocolo del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Se utilizará el software MAS5 (Affymetrix) para analizar las matrices escaneadas que contienen ~22 000 transcripciones de genes correspondientes a 14 500 genes humanos bien anotados. (5) El perfil de microbiota intestinal obtenido a partir de muestras de heces se procesará para la secuenciación metagenómica de escopeta y el perfil de ARNr 16S. El perfil de la microbiota intestinal se realizará a partir de muestras de heces que se congelarán inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservarán a un mínimo de -80 °C hasta su posterior procesamiento. Luego, las muestras serán procesadas por una tubería robótica automatizada que se desarrolló en el laboratorio Segal en Weizmann. Esta tubería funciona en formato de 96 pocillos y puede extraer ADN de 96 muestras de heces en un día, preparar bibliotecas de ADN Illumina para la secuenciación metagenómica de escopeta en otro día y llevar a cabo la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplexada del gen 16S rRNA en otro día. Por lo tanto, cada grupo de muestras de 96 heces recolectado puede procesarse robóticamente para la secuenciación 16S y metagenómica en 3 días bajo la supervisión de un técnico de laboratorio.
3. Análisis de datos y desarrollo algorítmico. (I) Microbiota: para estudiar exhaustivamente el papel del microbioma en la EM, los investigadores irán mucho más allá del análisis estándar de 16S rRNA y se adentrarán en el análisis de muestras completas de metagenoma de escopeta. Al secuenciar todo el contenido de ADN de las muestras de heces, la secuenciación del metagenoma puede proporcionar potencialmente mucha más información en comparación con 16S, ya que permite estudiar la estructura del genoma, las variantes estructurales y las funciones de las vías metabólicas y genéticas. Después de extraer estas características del microbioma (consulte a continuación en Resultados preliminares), los investigadores comenzarán empleando pruebas de asociación univariadas y multivariadas básicas, y continuarán con modelos de aprendizaje automático más complejos que intentan distinguir a las personas con EM de las que no la tienen en función de las características del microbioma. (objetivo 1), para clasificar la gravedad de la enfermedad (objetivo 2), para predecir el riesgo de recaída (objetivo 3), para diferenciar entre los fenotipos de la enfermedad de EM, es decir, síndrome radiológicamente aislado (RIS), síndrome clínicamente aislado (CIS), EM recurrente-remitente ( RRMS), EM progresiva primaria (PPMS), (objetivo 4) e identificar a los respondedores al tratamiento (objetivo 5). (II) Sangre: Para analizar la expresión de proteínas Partek Genomics Software (www.partek.com) se utilizará.
4. Análisis univariados y multivariados. Los investigadores primero calcularán la correlación (Pearson y Spearman) entre todas las características del microbioma extraídas de todos los individuos perfilados y las diferentes mediciones de los pacientes (puntuación EDSS, tiempo desde la recaída, etc.), y corregirán las múltiples hipótesis realizadas. Dado que los investigadores generarán una gran cantidad de características del microbioma y muchas de ellas están altamente correlacionadas entre sí, este análisis puede carecer de poder estadístico, especialmente dado que la cantidad de participantes será mucho menor que la cantidad de características. Por esta razón, los investigadores también realizarán análisis multivariados (p. ej., descomposición de valores singulares, análisis de componentes principales) ya que los componentes clave identificados por estos métodos capturan la principal variación en los datos de una manera que tiene en cuenta la estructura interna y las relaciones entre las diferentes características de entrada. Luego, los investigadores probarán si las proyecciones de los datos por cualquiera de los principales componentes principales en este análisis proporcionan una segregación significativa de los participantes por sus parámetros metabólicos medidos. Como un tipo diferente de análisis multivariado, los investigadores también emplearán diferentes métodos de agrupamiento no supervisados ​​(p. ej., agrupamiento jerárquico, bayesiano ingenuo) para agrupar a los participantes por sus datos de características de microbioma y luego examinarán los grupos en busca de enriquecimiento en parámetros metabólicos normales o anormales.

Algoritmos de aprendizaje automático. Como un enfoque más global destinado a cuantificar la contribución general del microbioma a la EM y a desentrañar la contribución relativa de las diferentes características del microbioma, los investigadores clasificarán a los participantes del estudio en varios grupos para cada objetivo (p. ej., en el objetivo 1 pacientes versus personas sanas). individuos; en el objetivo, 2 individuos con puntaje EDSS alto versus bajo para el mismo tiempo desde el diagnóstico de EM), y desarrollar diferentes métodos computacionales (por ejemplo, árboles de decisión potenciados, algoritmos de máquinas de vectores de soporte (SVM)) para este problema de clasificación usando solo las características del microbioma generado arriba. Los investigadores utilizarán un esquema de validación cruzada, mediante el cual el entrenamiento del modelo se realiza con los datos de un subconjunto de participantes elegido al azar y luego se prueba con los datos de los participantes retenidos restantes. Además, los investigadores dejarán de lado un conjunto de pruebas sobre el que los investigadores evaluarán el modelo final que se deriva en la validación cruzada, permitiendo una estimación fiel del rendimiento de nuestros modelos. Como la cantidad de características del microbioma y, por lo tanto, la cantidad de dimensiones es grande, los investigadores emplearán varios enfoques de selección de características como medio para evitar el sobreajuste y reducir la dimensionalidad. El laboratorio Segal (Weizmann) ha sido pionero en el desarrollo de varios de estos métodos en entornos similares en el área de la regulación genética. Los investigadores también utilizarán un esquema similar para predecir la puntuación EDSS continua que representa la gravedad de la EM. La configuración del problema es similar a la clasificación, pero el desarrollo del método es bastante diferente ya que los métodos de clasificación se reemplazan con métodos de tipo regresión (por ejemplo, regresión lineal, modelos probabilísticos, descenso de gradiente estocástico).