P.ベトナムにおけるアルテミシニンに対する熱帯熱マラリア耐性

3.1 研究デザイン この研究は、AS または DHA-PPQ による合併症のない熱帯熱マラリア原虫感染症の治療後の臨床的および寄生虫学的反応を評価するための無作為化非盲検 42 日間フォローアップ研究として設計されています。 研究基準を満たす熱帯熱マラリア原虫単一感染症の症候性患者は、研究に登録され、治療群の1つに無作為に割り付けられ、42日間追跡されます。 すべての薬物投与は直接観察され、患者は拡張WHOプロトコルに従って42日間積極的にフォローアップされます。 フォローアップ時間の終わりに、配偶子母細胞を運ぶすべての患者は、国のガイドラインに従ってプリマキン（0.75mg / kg）の単回投与で治療されます。

3.2. 研究場所と人口 この研究は、P.falciparum と P.vivax マラリアの発生率が国内で最も高い Gia Lai 省の Krong Pa 地区で実施されます。 この研究は、研究チームが地元の保健スタッフおよびマラリア患者がいるすべての周辺のコミューンの保健センターと協力するChu R'Camコミューンで行われます。

地元の人口は主に Gia Rai 少数民族で構成されており、主な職業は森林地帯での焼畑農業 (主にトウモロコシ、キャッサバ、米)、ゴム農園での季節労働、日用品の小規模生産です。自給自足または貿易。 コーヒーとカシューナッツ。 気候は熱帯性気候で、11 月から 4 月までが乾季、5 月から 10 月までが雨季です。 この地域は丘陵地帯で森林に覆われており（二次林）、主なマラリア媒介生物はハマダラカです。

3.4。 試験集団 対象集団には、CHC に自然発生したか、周囲の CHC の医療スタッフから紹介されたすべての熱帯熱マラリア原虫感染患者が含まれます。

3.5。 治験手順 3.5.1 スクリーニング。 スクリーニング中に基本的な登録基準を満たすすべての相談患者には、連続したスクリーニング番号が割り当てられ、医師によってより詳細に評価されます。 患者がすべての登録基準を満たした時点で、患者 (子供の場合は親または保護者) に研究への参加の同意を求め、研究番号 (ID = 連番) を割り当てます。 研究に参加しないことを決定した人は、保健省によって確立されたケアの基準に従って、医療施設のスタッフによって検査、治療、およびフォローアップされます。

3.5.2. 無作為化と治療の割り当て 無作為化は、1:1 の割り当て比率で 10 のブロックで実行されます。

登録時に、患者は面接を受け、身体検査を受け、標準化された事前コード化されたアンケートに記入されます。 静脈血サンプルは、登録時にすべての患者から EDTA またはクエン酸デキストロース (EDTA/ACD) を含む滅菌バキュテナー チューブに収集されます。 成人からは最低 5ml、最大 8ml の血液が採取され、子供からは 1ml/kg で最大 5ml が採取されます。 500 μL の RNAprotect 試薬 (Qiagen) を含む 1.5 ml チューブに 2 滴の血液を加えます。

3.5.3 治療 すべての患者は、早期の寄生虫除去を評価するために、AS 単独 (4mg/kg/日) または DHA-PPQ (目標用量 DHA=4mg/kg/日) のいずれかの完全な治療を 3 日間受けます。 熱帯熱マラリア原虫の治療には 3 日間の AS コースでは不十分であるため、WHO の推奨に従って、追加の 3 日間の DHA-PPQ レジメンによって完了する予定です。 副作用や嘔吐の治療後、患者は 60 分間観察されます。 最初の 30 分以内に薬を嘔吐した患者は、全量を繰り返し服用します。 30 ～ 60 分間嘔吐した場合は、半量になります。

レスキュー薬は、国のガイドラインに従って投与されます。

レスキュー経口薬: キニーネ (30mg/kg/日) およびクリンダマイシン (15mg/kg/日) を 7 日間。レスキュー IV 薬: キニーネ (30mg/kg/日) およびドキシサイクリン (3mg/kg/日) を 7 日間 3.5.4. フォローアップ 0日目から寄生虫駆除まで：抗マラリア薬の初回投与が投与され、1時間観察された後、少なくとも3日目まで、必要に応じて2日と定義される寄生虫駆除まで、血液顕微鏡検査によって患者を12時間ごとに監視しますネガティブスライドの連続。 来院ごとに、患者は面接を受けて身体検査を受け、フォローアップフォームに記入され、有害事象があれば記録されます。 指刺し血液サンプルは、次の結果のために収集されます: LM 観察用の 2 つの血液スライド (厚膜および薄膜)、後の DNA 抽出用の EDTA/ACD マイクロテナー チューブへの 200 μl の血液、および別のマイクロテナーへの 2 滴の血液後で RNA を抽出するための RNAprotect を含むチューブ。 Hb濃度を測定するために、3日目に追加の血液を採取します。

7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目 患者はその後、各フォローアップ訪問のためにクリニックに出席する（または自宅を訪問する）ように求められます。その間、患者はインタビューを受けて検査されます。完了し、有害事象があれば文書化します。 指刺し血液サンプルは、次の結果のために収集されます: LM 観察用の 2 つの血液スライド (厚膜および薄膜)、DNA 抽出用の EDTA/ACD マイクロテイナー チューブ内の 200 μl の血液、およびマイクロテイナー チューブを含む RNAprotect 内の 2 滴の血液. 7、14、28、および 42 日目に、Hb 濃度 (Hemocue) のために 1 滴の血液を採取します。

熱帯熱マラリア原虫再発の日 再発は、患者のフォローアップ期間中および最初の寄生虫クリアランス後に LM 検査によって検出された熱帯熱マラリア原虫血症として定義されます。 再発が確認された場合は、レスキュー治療の投与前に、さらに静脈血サンプルが採取されます (最小 5ml/最大 8ml): 血液の一部を用いて生体外アッセイが行われ、残りは薬剤耐性に関する将来の調査のために凍結保存されます。メカニズム。

3.5.5. フォローアップの喪失とプロトコル違反 フォローアップの喪失は、あらゆる合理的な努力にもかかわらず、登録された患者が予定された来院に出席せず、見つからない場合に発生します。 これらの患者に割り当てられる治療結果はありません。 これらの患者は追跡不能として分類され、分析から除外または除外されます。 以下の基準のいずれかを満たす研究患者は、撤回されたと分類されます。 i) 同意の撤回。 ii) 治療を完了できなかった; iii) 登録違反。 iv) 自発的なプロトコル違反。 v) 非自発的プロトコル違反。

3.5.6 検査手順と評価 顕微鏡検査: スクリーニング時に 3 枚のスライド (薄いフィルム、厚いフィルム、薄いフィルム) を取得する必要があります。 最初のスクリーニングのために、1 つのスライドを急速に染色します (10% ギムザで 15 分間)。 患者が登録されると、他の 2 つのスライドがより慎重に染色されます (3% ギムザで 45 分間)。 寄生虫の密度は、200 個の白血球 (WBC) あたりの無性寄生虫の数をハンド タリー カウンターで数えることによって決定されます。 200 WBC に達する前に 500 を超える寄生虫がカウントされた場合、カウントはフィールドの完了後に停止されます。 密度は、血液 1 μl あたりの無性寄生虫の数として表され、無性寄生虫の数を計数された白血球の数で割って計算され、推定された白血球密度 (通常、1 μl あたり 8000) によって補正されます。 無性寄生虫の数がフォローアップ塗抹標本で 200 個の白血球あたり 10 個未満の場合、カウントは少なくとも 500 個の白血球に対して行われます。 1000個の白血球の検査で無性寄生虫が見つからない場合、血液スライドは陰性と見なされます。 配偶子母細胞密度は、500 WBCs あたりの配偶子母細胞の数を数えることによって計算されます。

ヘモグロビン (Hb) 濃度は、製造元の指示に従って Hemocue を使用して、マイクロキュベットに収集された全血で測定されます。

熱帯熱マラリア原虫の分子検出: DNA は、microtainer で収集された指を刺した血液サンプルから抽出されます。 ０日目のマラリア原虫種（Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｏｖａｌｅおよびＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）の分子確認は、１８Ｓリボソーム遺伝子を標的とするｑＰＣＲによって行われる。 同じ qPCR メソッドを使用して、0 日目の熱帯熱マラリア原虫の感染を特定および定量化し、サンプルを追跡します。

再燃/新規感染の熱帯熱マラリア原虫のジェノタイピング: 再発性感染のジェノタイピングは、他の場所で説明されているように、マラリア原虫ゲノムの単一コピー遺伝子である MSP1、MSP2、および GLURP を特徴付けることによって行われます。

配偶子母細胞の RNA 抽出と RT-qPCR: RNA は、アフィニティーカラムとゲノム DNA の DNAse 消化を使用して、RNAprotect サンプルから抽出されます。 P. falciparum 配偶子母細胞の段階を検出および定量化するために、Pfs25 遺伝子転写物をターゲットとする逆転写 qPCR (RT-qPCR) が、0 日目およびすべてのフォローアップ サンプルで行われ、前述のプロトコルに変更が加えられます。

Ex vivo 薬物感受性アッセイ: EDTA/ACD チューブに採取された静​​脈血 (0 日目および再発日) は、採取後 6 時間以内に処理されます。 血液を遠心分離し、血漿と軟膜を取り除き、-20℃で保存します。 赤血球をRPMIで2回洗浄し、培地(RPMI 1640 LPLF液体培地)に再懸濁して50%ヘマトクリット血液培地混合物(BMM)にする。

標準的な ex vivo 薬物感受性アッセイ: 評価は、アルテミシニンに対する熱帯熱マラリア原虫の応答の評価のための WHO ガイドライン「抗マラリア薬に対するヒト マラリア原虫の感受性に関する in vitro アッセイのフィールド アプリケーション」に従います。

Ex vivo リング ステージ生存アッセイ (RSA) 標準的な ex vivo アッセイに加えて、リング ステージ生存アッセイ (RSA) のパフォーマンスは、公開されたプロトコルに従って調査されます。

アルテミシニン耐性の分子マーカー: 抽出された DNA は、アルテミシニン耐性の候補耐性分子マーカーとして最近同定された、P. falciparum Kelch プロペラ ドメイン (K13) の点変異の遺伝子型決定に使用されます。 簡単に言えば、K13 は、WWARN 手順 INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures] に記載されているプラ​​イマーを使用してネステッド PCR で増幅されます。 アガロースゲル電気泳動で確認した後、生成物を配列決定して分析し、多型を特定します。 アルテミシニン耐性の今後の代替候補も調査される可能性があります。 これらの訪問中に、症例報告書 (CRF) に記録された情報は、ソース ドキュメント (検査記録や診療記録など) と照らし合わせて検証されます。 治験終了時に CRF フォームが照合された後、それらの完全性と正確性が審査されます。 データは現場で電子データベース (Epi Info) に二重に入力され、特別に設計されたコンピューター チェックを使用して、データ入力の不一致、無効なデータ範囲、および全体的な一貫性が特定されます。 すべての不一致は、元のチェック済みデータ収集フォームを参照することで解決されます。

入院時のすべての血液フィルムは、研究サイトで、また調整センターの上級顕微鏡士によって読み取られます。 さらに、ランダムに選択されたスライドの 10% に対して ITM で外部品質管理が行われます。 分子アッセイ (qPCR、RT-qPCR、寄生虫ジェノタイピング) のそれぞれについて、NIMPE で処理されたサンプルの 10% がランダムに選択され、ITM で再分析されます。 ex vivo 薬物アッセイ結果の外部品質管理は ITM で行われ、ランダムに選択された分離株の 10% についてスライドが再検査されます。

5. 統計分析計画 寄生虫クリアランス時間は、患者の治療 (最初の投与) 時間から 2 つの連続する陰性血液スライドの最初までの経過時間 (時間単位) として定義されます。 WWRN が開発した PCE オンライン ツールを使用して、寄生虫クリアランスの時間と速度、およびラグ フェーズを適合させます。 42 日間の治癒率の分析は、修正された治療意図 (mITT) 患者集団 (すべて無作為化された患者) と評価可能な患者集団 (プロトコルごと) の両方に対して実行されます。 寄生虫数が 26/40 日目まで記録されているか、または寄生虫の再発による「不十分な治療効果」のために患者が中止した場合、患者は 28/42 日の治癒率の分析のために評価可能です。 mITT 分析には、「不十分な治療効果」以外の理由で 28 日目または 42 日目より前に中止した患者も含まれます (たとえば、これには、嘔吐の繰り返しによる「有害な経験」が含まれる可能性があります)。 これらの患者は、中断の理由に関係なく、治療の失敗として mITT 分析でカウントされます。 抗マラリア効果のある抗生物質による併用治療を受けた患者は、評価可能な患者から除外され、mITT に含まれます。

カテゴリ変数のパーセンテージと対応する 95% 信頼区間は、ウィルソンの方法を使用して計算されます。 比率は、必要に応じてイェーツの補正またはフィッシャーの正確確率検定で *2 を計算することによって比較されます。 正規分布の連続データは、平均値と標準偏差として要約され、スチューデントの t 検定と分散分析によって比較されます。 正規分布に準拠しないデータは、中央値 (IQR) または幾何平均として要約され、Mann-Whitney U 検定または Kruskal-Wallis 分散分析によって比較されます。 2 つの連続変数間の関連性は、Spearman の順位相関係数を使用して評価されます。

28日目および42日目までの治療失敗のリスクはすべて、カプランマイヤー法によって計算された累積発生率を用いた生存分析によって評価され、Mantel-Haenszelログランク検定によって比較されます。

寄生虫、発熱および配偶子母細胞のクリアランス時間も、カプラン マイヤー法によって評価されます。

治療の最初の週の血液学的変化、および毎週のフォローアップ中の回復は、それぞれ0、3、7、および14、28、42日目のHb濃度の変化を測定することによって評価されます。

6. 倫理的問題 倫理的クリアランス 研究を実施するための倫理的クリアランスは、国立マラリア学、寄生虫学および昆虫学研究所、ハノイおよびアントワープ大学の倫理委員会、ならびに ITM の治験審査委員会から取得されます。 、アントワープ。

インフォームドコンセント 患者は、彼ら（または親または子供の保護者）がインフォームドコンセントを与える場合にのみ研究に含まれます。 同意要求は英語で入手でき、ベトナム語に翻訳され、患者、親または保護者に完全に読まれます。 試験の詳細とその利点と潜在的なリスクについて説明します。 質問に回答すると、書類に署名が求められます。 患者が読み書きができない場合は、読み書きができる証人が署名する必要があります。可能であれば、署名者は参加者によって選択され、研究チームとは関係ありません。