P. Falciparum Motstand mot Artemisinin i Vietnam

3.1 Studiedesign Denne studien er designet som en randomisert åpen 42-dagers oppfølgingsstudie for å evaluere de kliniske og parasittologiske responsene etter behandling av ukompliserte P.falciparum-infeksjoner med enten AS eller DHA-PPQ. Symptomatiske pasienter med P.falciparum mono-infeksjoner, som oppfyller studiekriteriene, vil bli registrert i studien, randomisert til en av behandlingsarmene og fulgt opp i 42 dager. All legemiddeladministrasjon vil bli observert direkte og pasientene vil bli aktivt fulgt opp i 42 dager i henhold til en utvidet WHO-protokoll. Ved slutten av oppfølgingstiden vil alle pasienter som bærer gametocytter bli behandlet med en enkelt dose Primaquine (0,75 mg/kg) i henhold til nasjonale retningslinjer.

3.2. Studiested og befolkning Studien vil bli utført i Krong Pa-distriktet, Gia Lai-provinsen, hvor både P.falciparum og P.vivax malariaforekomster er de høyeste i landet. Studien vil bli lokalisert i Chu R'Cam kommune hvor studieteamet vil jobbe sammen med det lokale helsepersonellet og alle omkringliggende kommuners helsesentre med malariapasienter.

Lokalbefolkningen er hovedsakelig sammensatt av den etniske minoriteten Gia Rai hvis hovedyrker består av slash and burn jordbruk (hovedsakelig mais, maniok og ris) i skogsmarker, sammen med sesongarbeid i gummiplantasjer, og småskala produksjon av varer til daglig. livsopphold eller handel f.eks. kaffe og cashewnøtter. Klimaet er tropisk med en tørr sesong fra november til april og regntiden fra mai til oktober. Området er kupert og skogkledd (sekundærskog) og den viktigste malariavektoren er Anopheles dirus.

3.4. Forsøkspopulasjon Målpopulasjonen inkluderer alle P. falciparum-infiserte pasienter som enten presenterer seg spontant til CHC eller blir henvist av helsepersonellet til de omkringliggende CHC-ene.

3.5. Prøveprosedyrer 3.5.1 Screening. Alle konsulterende pasienter som oppfyller de grunnleggende innmeldingskriteriene under screening vil bli tildelt et fortløpende screeningnummer og evaluert i større dybde av legen. Når pasienten oppfyller alle påmeldingskriteriene, vil han eller hun (eller en forelder eller foresatt i tilfelle barn) bli bedt om samtykke til å delta i studien og vil bli tildelt et studienummer (ID=sekvensnummerering). Enhver som bestemmer seg for ikke å delta i studien vil bli undersøkt, behandlet og fulgt opp av helsepersonell i henhold til standarden for omsorg fastsatt av Helsedepartementet.

3.5.2. Randomisering og behandlingstildeling Randomisering vil bli utført i blokker på 10 med et tildelingsforhold på 1:1.

Ved påmelding vil pasienten bli intervjuet og undersøkt fysisk og et standardisert forhåndskodet spørreskjema vil bli fylt ut. En venøs blodprøve vil bli samlet inn i sterile vacutainer-rør som inneholder EDTA eller syre-sitrat-dekstrose (EDTA/ACD) fra alle pasienter ved registrering. Minimum 5 ml blod - og maksimalt 8 ml - vil bli samlet inn fra voksne, og 1 ml/kg opptil 5 ml vil bli samlet inn fra barn. To bloddråper tilsettes i et 1,5 ml rør som inneholder 500 µL RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.3 Behandling Alle pasienter vil motta en full behandling av enten AS alene (4mg/kg/dag) eller DHA-PPQ (måldose DHA=4mg/kg/dag) i 3 dager for å evaluere tidlig parasitt-clearance. Siden en 3-dagers kur med AS er utilstrekkelig for å behandle P.falciparum, vil den bli fullført med en ekstra 3-dagers DHA-PPQ-kur i henhold til WHOs anbefalinger. Pasienter vil bli observert i 60 minutter etter behandling for bivirkninger eller oppkast. De pasientene som kaster opp medisinen innen de første 30 minuttene vil få en gjentatt full dose; de som kaster opp fra 30-60 minutter vil få halv dose.

Redningsmedisiner vil bli gitt følgende nasjonale retningslinjer:

Rednings oralt legemiddel: Kinin (30 mg/kg/dag) og klindamycin (15 mg/kg/dag) i 7 dager; Rescue IV medikament: Kinin (30 mg/kg/dag) og doksycyklin (3 mg/kg/dag) i 7 dager 3.5.4. Oppfølging Fra dag 0 til parasitt-clearance: etter at den første dosen av antimalariamedikamentet er administrert og observert i én time, vil pasientene bli overvåket hver 12. time ved blodmikroskopi minst til dag 3 og lenger om nødvendig til parasittclearance definert som to påfølgende negative lysbilder. Ved hvert besøk vil pasienten bli intervjuet og undersøkt fysisk, oppfølgingsskjemaet utfylt og eventuelle uønskede hendelser dokumentert. En blodprøve med fingerstikk vil bli samlet inn for følgende utfall: to blodglass for LM-observasjon (tykk og tynn film), 200 µl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør for senere DNA-ekstraksjon, og 2 dråper blod i en annen mikrotainer rør som inneholder RNAprotect for senere RNA-ekstraksjon. En ekstra dråpe blod vil bli tatt på dag 3 for å måle Hb-konsentrasjonen.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Pasientene vil da bli bedt om å komme til klinikken (eller besøkes hjemme) for hvert oppfølgingsbesøk, hvor de vil bli intervjuet og undersøkt, oppfølgingsskjemaet vil fullføres og eventuelle uønskede hendelser dokumenteres. En blodprøve med fingerstikk vil bli samlet inn for følgende utfall: to blodglass for LM-observasjon (tykk og tynn film), 200 μl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør for DNA-ekstraksjon, og 2 dråper blod i RNAprotect-inneholdende mikrotainerrør . På dag 7, 14, 28 og 42 vil en dråpe blod bli tatt for Hb-konsentrasjon (hemokue).

Dag for P. falciparum-residiv Residiv er definert som enhver P.falciparum-parasitemi som påvises ved LM-undersøkelse under pasientens oppfølgingsperiode og etter initial parasitt-clearance. Hvis residiv bekreftes, vil en ytterligere venøs blodprøve tas (minimum 5 ml/maksimum 8 ml) før administrasjon av redningsbehandling: ex-vivo-analyser vil bli utført med én del av blodet mens resten vil bli kryopreservert for fremtidige undersøkelser av medikamentresistens mekanismer.

3.5.5. Tap til oppfølging og brudd på protokollen Tap til oppfølging oppstår når, til tross for alle rimelige anstrengelser, en registrert pasient ikke deltar på de planlagte besøkene og ikke kan bli funnet. Ingen behandlingsresultater vil bli tildelt disse pasientene. Disse pasientene vil bli klassifisert som tapt for oppfølging og sensurert eller ekskludert fra analysen. Studiepasienter som oppfyller noen av følgende kriterier vil bli klassifisert som trukket tilbake: i) tilbaketrekking av samtykke; ii) manglende fullføring av behandlingen; iii) brudd på registreringen; iv) frivillig brudd på protokollen; v) ufrivillig brudd på protokollen.

3.5.6 Laboratorieprosedyrer og evaluering Mikroskopi: tre objektglass (tynne og tykke og tynne filmer) bør oppnås ved screening. Ett objektglass vil bli farget raskt (10 % Giemsa i 15 minutter) for innledende screening. Når pasienten er registrert, vil de to andre objektglassene farges mer forsiktig (3 % Giemsa i 45 minutter). Parasitttettheten vil bli bestemt ved å telle antall aseksuelle parasitter per 200 hvite blodceller (WBCs) med en håndteller. Hvis mer enn 500 parasitter er blitt talt før de når 200 WBC, vil tellingen stoppes etter fullført felt. Tetthet, vil bli uttrykt som antall aseksuelle parasitter per µl blod, vil bli beregnet ved å dele antall aseksuelle parasitter med antall WBC-er som telles og korrigeres med den estimerte WBC-tettheten (typisk 8000 per µl). Når antallet aseksuelle parasitter er mindre enn 10 per 200 hvite blodlegemer i oppfølgingsutstryk, vil det telles mot minst 500 hvite blodlegemer. Et blodskred vil bli ansett som negativt når undersøkelse av 1000 hvite blodlegemer ikke avdekker aseksuelle parasitter. Gametocyttetthet vil bli beregnet ved å telle antall gametocytter per 500 WBC.

Hemoglobin (Hb) konsentrasjon vil bli målt på fullblod samlet inn i mikrokyvette ved hjelp av Hemocue etter produsentens instruksjoner.

P. falciparum molekylær deteksjon: DNA vil bli ekstrahert fra fingerstikk blodprøver samlet i mikrotainere. Molekylær bekreftelse av Plasmodium-arter (P.vivax, P.falciparum, P.ovale og P.malariae) på dag 0 vil bli utført med qPCR rettet mot 18S ribosomalt gen. Den samme qPCR-metoden vil bli brukt til å identifisere og kvantifisere P. falciparum-infeksjoner på dag 0 og følge opp prøver.

P. falciparum genotyping for gjengang/ny infeksjon: genotyping av de tilbakevendende infeksjonene vil bli gjort ved å karakterisere MSP1, MSP2 og GLURP, enkeltkopi gener i Plasmodium falciparum genomet som beskrevet andre steder.

RNA-ekstraksjon og RT-qPCR for gametocytter: RNA vil bli ekstrahert fra RNAprotect-prøver ved bruk av affinitetskolonner og DNAse-fordøyelse av genomisk DNA. For å oppdage og kvantifisere P. falciparum gametocyttstadier vil en revers transkripsjon qPCR (RT-qPCR) rettet mot Pfs25-gentranskripsjoner bli utført på dag 0 og i alle oppfølgingsprøver, etter tidligere beskrevne protokoller med modifikasjoner.

Ex vivo legemiddelsensitivitetsanalyser: venøst ​​blod samlet i EDTA/ACD-rør (på dag 0 og dag for tilbakefall) vil bli behandlet innen 6 timer etter innsamling. Blod vil bli sentrifugert og plasma og buffy coat fjernes og lagres ved -20ºC. Røde blodlegemer vil bli vasket to ganger i RPMI og resuspendert i kulturmedium (RPMI 1640 LPLF flytende medium) til en 50 % hematokritt-blodmediumblanding (BMM).

Standard ex vivo legemiddelsensitivitetsanalyse: vurderingen vil følge WHOs retningslinjer "Field application of in vitro assay for the sensitivity of human malaria parasites to antimalaria drugs" for assessment of the response of P. falciparum to artemisinins".

Ex vivo ring stage survival assays (RSA) I tillegg til standard ex vivo assays, vil ytelsen til ring stage survival assays (RSA) bli utforsket etter en publisert protokoll.

Molekylære markører for artemisininresistens: ekstrahert DNA vil bli brukt til å genotype punktmutasjoner i P. falciparum Kelch propelldomene (K13), som nylig har blitt identifisert som kandidatresistens molekylære markører for artemisininresistens. Kort fortalt vil K13 bli amplifisert i en nestet PCR ved bruk av primere beskrevet i WWARN-prosedyre INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Etter bekreftelse av agarosegelelektroforese vil produktene sekvenseres og analyseres for å identifisere polymorfismer. Alternative kommende kandidater for artemisinin-resistens kan også utforskes. 4. KVALITETSSIKRING Stedsovervåkingsbesøk vil bli planlagt regelmessig. Under disse besøkene vil informasjon som er registrert på saksrapportskjemaene (CRF) verifiseres mot kildedokumenter (f.eks. laboratoriejournaler og klinikkregistre). Etter at CRF-skjemaene er samlet på slutten av prøven, vil de bli gjennomgått for fullstendighet og nøyaktighet. Dataene vil bli dobbeltregistrert på stedet i en elektronisk database (Epi Info), der spesialdesignede datasjekker brukes for å identifisere datainntastingsavvik, ugyldige dataområder og generell konsistens. Alle avvik vil bli løst ved å referere til de originale sjekkede datainnsamlingsskjemaene.

Alle blodfilmer ved innleggelse vil bli lest på studiestedet samt av en seniormikroskopist ved et koordinerende senter. I tillegg vil det bli gjort en ekstern kvalitetskontroll på ITM på 10 % av tilfeldig valgte lysbilder. For hver av de molekylære analysene (qPCR, RT-qPCR og parasittgenotyping) vil 10 % av prøvene behandlet ved NIMPE bli tilfeldig valgt for å bli analysert på nytt ved ITM. Ekstern kvalitetskontroll av ex vivo medisinanalyseresultater vil bli utført ved ITM hvor objektglassene vil bli undersøkt på nytt for 10 % av tilfeldig valgte isolater.

5. Plan for statistisk analyse Parasittens clearance-tid er definert som tiden (i timer) som har gått fra pasientens behandlingstid (første dose) til den første av to påfølgende negative blodlys. Parasittklareringstid og -rate samt etterslepfase vil bli tilpasset ved hjelp av PCE online-verktøyet utviklet av WWARN. Analysen av kurraten på 42 dager vil bli utført både for den modifiserte intention-to-treat (mITT) pasientpopulasjonen (alle randomiserte pasienter) og den evaluerbare pasientpopulasjonen (Per Protocol). Pasienter er evaluerbare for analyse av kurraten på 28/42 dager hvis parasittantall registreres opp til dag 26/40 eller pasienten avbryter på grunn av "Utilfredsstillende terapeutisk effekt" på grunn av gjenopptreden av parasitter. mITT-analysen inkluderer også pasienter som avbryter behandlingen før dag 28/42 på grunn av andre årsaker enn "Utilfredsstillende terapeutisk effekt" (f.eks. kan dette inkludere "Uønskede opplevelse(r)" på grunn av gjentatt oppkast). Disse pasientene vil bli regnet i mITT-analysen som behandlingssvikt uavhengig av årsaken til seponering. Pasienter som har hatt samtidig behandling med antibiotika som har en anti-malaria effekt vil bli ekskludert fra de evaluerbare pasientene og inkludert i mITT.

For kategoriske variabler vil prosenter og tilsvarende 95 % konfidensintervall beregnes ved bruk av Wilsons metode. Proporsjoner vil bli sammenlignet ved å beregne *2 med Yates' korreksjon eller ved Fishers eksakte test der det er aktuelt. Normalfordelte kontinuerlige data vil bli oppsummert som gjennomsnitt og standardavvik, og sammenlignet med Students t-test og variansanalyse. Data som ikke samsvarer med en normalfordeling vil bli oppsummert som medianer (IQR) eller geometriske gjennomsnitt og sammenlignet med Mann-Whitney U-testen eller Kruskal-Wallis variansanalyse. Sammenhengen mellom 2 kontinuerlige variabler vil bli vurdert ved å bruke Spearmans rangkorrelasjonskoeffisient.

Risikoen for behandlingssvikt innen dag 28 og 42 vil alle bli evaluert ved overlevelsesanalyse med kumulative forekomster beregnet ved Kaplan Meier-metoden og sammenlignet med Mantel-Haenszel log rank test.

Parasitt-, feber- og gametocyttclearance-tider vil også bli evaluert ved Kaplan Meier-metoden.

Hematologiske endringer i løpet av den første behandlingsuken samt restitusjon under ukentlig oppfølging vil bli evaluert ved å måle endringene i Hb-konsentrasjon mellom henholdsvis dag 0, 3, 7 og dag 14, 28 og 42.

6. ETISKE SPØRSMÅL Etiske godkjenninger Etisk godkjenning for å gjennomføre studien vil ha blitt innhentet fra Etikkkomiteen ved National Institute of Malariology, Parasitology and Entomology, Hanoi og Universitetet i Antwerpen, samt fra Institutional Review Board ved ITM , Antwerpen.

Informert samtykke Pasienter vil bare bli inkludert i studien hvis de (eller foreldre eller foresatte til barn) gir informert samtykke. Samtykkeforespørselen er tilgjengelig på engelsk og oversatt til vietnamesisk språk vil bli lest i sin helhet for pasienten, forelderen eller foresatt. Detaljer om prøven og dens fordeler og potensielle risikoer vil bli forklart. Når eventuelle spørsmål er besvart, vil det bli bedt om en signatur på dokumentet. Hvis pasienten er analfabet, må et lesekyndig vitne skrive under; om mulig vil underskriveren velges av deltakeren og vil ikke ha noen tilknytning til forskerteamet.