P. Falciparum Odporność na artemizynę w Wietnamie

3.1 Projekt badania To badanie zostało zaprojektowane jako randomizowane, otwarte, 42-dniowe badanie kontrolne w celu oceny odpowiedzi klinicznych i parazytologicznych po leczeniu niepowikłanych zakażeń P. falciparum za pomocą AS lub DHA-PPQ. Objawowi pacjenci z monoinfekcją P. falciparum, spełniający kryteria badania, zostaną włączeni do badania, przydzieleni losowo do jednej z grup leczenia i obserwowani przez 42 dni. Wszystkie podawane leki będą bezpośrednio obserwowane, a pacjenci będą aktywnie obserwowani przez 42 dni zgodnie z rozszerzonym protokołem WHO. Pod koniec okresu obserwacji wszyscy pacjenci będący nosicielami gametocytów otrzymają pojedynczą dawkę Primachiny (0,75 mg/kg) zgodnie z krajowymi wytycznymi.

3.2. Miejsce badania i populacja Badanie zostanie przeprowadzone w dystrykcie Krong Pa w prowincji Gia Lai, gdzie częstość występowania malarii P. falciparum i P. vivax jest najwyższa w kraju. Badanie zostanie zlokalizowane w gminie Chu R'Cam, gdzie zespół badawczy będzie współpracował z lokalnym personelem medycznym i wszystkimi okolicznymi gminnymi ośrodkami zdrowia, w których przebywają chorzy na malarię.

Miejscowa ludność składa się głównie z mniejszości etnicznej Gia Rai, której głównym zajęciem jest cięcie i wypalanie upraw (głównie kukurydzy, manioku i ryżu) na polach leśnych, a także praca sezonowa na plantacjach kauczuku oraz produkcja na małą skalę towarów codziennego użytku utrzymanie lub handel, np. kawa i orzechy nerkowca. Klimat jest tropikalny z porą suchą od listopada do kwietnia i porą deszczową od maja do października. Obszar ten jest pagórkowaty i zalesiony (lasy wtórne), a głównym nosicielem malarii jest Anopheles dirus.

3.4. Populacja badana Populacja docelowa obejmuje wszystkich pacjentów zakażonych P. falciparum, którzy spontanicznie zgłaszają się do CHC lub są kierowani przez personel medyczny okolicznych CHC.

3.5. Procedury badawcze 3.5.1 Badanie przesiewowe. Wszystkim zgłaszającym się pacjentom, którzy podczas skriningu spełnią podstawowe kryteria kwalifikacji, zostanie nadany kolejny numer skriningowy i dokładniej oceniony przez lekarza. Po spełnieniu przez pacjenta wszystkich kryteriów włączenia, on (lub rodzic lub opiekun w przypadku dzieci) zostanie poproszony o wyrażenie zgody na udział w badaniu i zostanie mu nadany numer badania (ID=kolejna numeracja). Każda osoba, która nie zdecyduje się na udział w badaniu, zostanie przebadana, leczona i objęta opieką przez personel placówki zgodnie ze standardami opieki określonymi przez Ministerstwo Zdrowia.

3.5.2. Randomizacja i alokacja leczenia Randomizacja będzie przeprowadzana w blokach po 10 ze stosunkiem alokacji 1:1.

Podczas rejestracji pacjent zostanie przesłuchany i poddany badaniu fizycznemu oraz zostanie wypełniony standardowy, wstępnie zakodowany kwestionariusz. Próbka krwi żylnej zostanie pobrana do sterylnych probówek Vacutainer zawierających EDTA lub kwaśno-cytrynianowo-dekstrozową (EDTA/ACD) od wszystkich pacjentów podczas rekrutacji. Od dorosłych zostanie pobrane co najmniej 5 ml krwi, a maksymalnie 8 ml, a od dzieci 1 ml/kg do 5 ml. Dwie krople krwi zostaną dodane do 1,5 ml probówki zawierającej 500 µl odczynnika RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Leczenie Wszyscy pacjenci otrzymają pełne leczenie samego AS (4mg/kg/dzień) lub DHA-PPQ (dawka docelowa DHA=4mg/kg/dzień) przez 3 dni w celu oceny wczesnego usunięcia pasożyta. Ponieważ 3-dniowy kurs AS jest niewystarczający do leczenia P. falciparum, zostanie on uzupełniony dodatkowym 3-dniowym schematem DHA-PPQ zgodnie z zaleceniami WHO. Pacjenci będą obserwowani przez 60 minut po leczeniu pod kątem działań niepożądanych lub wymiotów. Pacjenci wymiotujący lekiem w ciągu pierwszych 30 minut otrzymają powtórną pełną dawkę; osoby wymiotujące od 30 do 60 minut otrzymają połowę dawki.

Leki ratunkowe zostaną podane zgodnie z krajowymi wytycznymi:

Ratunkowy lek doustny: chinina (30 mg/kg/dzień) i klindamycyna (15 mg/kg/dzień) przez 7 dni; Lek doraźny IV: chinina (30 mg/kg/dzień) i doksycyklina (3 mg/kg/dzień) przez 7 dni 3.5.4. Obserwacja Od dnia 0 do usunięcia pasożyta: po podaniu pierwszej dawki leku przeciwmalarycznego i obserwowaniu przez jedną godzinę, pacjenci będą monitorowani co 12 godzin za pomocą mikroskopii krwi co najmniej do dnia 3 i dłużej, jeśli to konieczne, do usunięcia pasożyta zdefiniowanego jako dwa kolejne negatywne slajdy. Podczas każdej wizyty pacjent zostanie przesłuchany i poddany badaniu fizykalnemu, wypełniony zostanie formularz kontrolny, a wszelkie zdarzenia niepożądane zostaną udokumentowane. Próbka krwi pobrana z palca zostanie pobrana w celu uzyskania następujących wyników: dwa preparaty krwi do obserwacji LM (gruby i cienki film), 200 µl krwi do probówki microtainer EDTA/ACD w celu późniejszej ekstrakcji DNA oraz 2 krople krwi do innego mikrotainera probówka zawierająca RNAprotect do późniejszej ekstrakcji RNA. Dodatkowa kropla krwi zostanie pobrana w dniu 3 w celu zmierzenia stężenia Hb.

Dzień 7, 14, 21, 28, 35, 42 Pacjenci zostaną następnie poproszeni o przybycie do kliniki (lub wizytę w domu) na każdą wizytę kontrolną, podczas której zostanie przeprowadzony wywiad i badanie, formularz kontrolny zostać zakończone, a wszelkie zdarzenia niepożądane udokumentowane. Próbka krwi z nakłucia palca zostanie pobrana w celu uzyskania następujących wyników: dwa preparaty krwi do obserwacji LM (gruby i cienki film), 200 μl krwi w probówce microtainer EDTA/ACD do ekstrakcji DNA oraz 2 krople krwi w probówce microtainer zawierającej RNAprotect . W dniach 7, 14, 28 i 42 zostanie pobrana jedna kropla krwi na stężenie Hb (Hemocue).

Dzień nawrotu P. falciparum Nawrót definiuje się jako jakąkolwiek parazytemię P. falciparum wykrytą w badaniu LM w okresie obserwacji pacjenta i po początkowym usunięciu pasożyta. Jeśli nawrót zostanie potwierdzony, zostanie pobrana kolejna próbka krwi żylnej (minimum 5 ml/maksymalnie 8 ml) przed podaniem leku ratunkowego: testy ex vivo zostaną wykonane z jedną częścią krwi, a pozostała część zostanie zamrożona do przyszłych badań lekooporności mechanizmy.

3.5.5. Utrata obserwacji i naruszenia protokołu Utrata obserwacji ma miejsce, gdy pomimo wszelkich uzasadnionych wysiłków zapisany pacjent nie przychodzi na zaplanowane wizyty i nie można go znaleźć. Takim pacjentom nie zostanie przypisany żaden wynik leczenia. Pacjenci ci zostaną sklasyfikowani jako utraconi z obserwacji i ocenzurowani lub wykluczeni z analizy. Badani pacjenci, którzy spełniają którekolwiek z poniższych kryteriów, zostaną sklasyfikowani jako wycofani: i) wycofanie zgody; ii) nieukończenie leczenia; iii) naruszenie zasad rejestracji; iv) dobrowolne naruszenie protokołu; v) mimowolne naruszenie protokołu.

3.5.6 Procedury laboratoryjne i ocena Mikroskopia: podczas badania przesiewowego należy uzyskać trzy preparaty (cienkie i grube oraz cienkie błony). Jedno szkiełko zostanie szybko wybarwione (10% Giemsa przez 15 minut) do wstępnego badania przesiewowego. Po wpisaniu pacjenta pozostałe dwa szkiełka zostaną dokładniej wybarwione (3% Giemsa przez 45 min). Gęstość pasożytów zostanie określona przez zliczenie liczby pasożytów bezpłciowych na 200 białych krwinek (WBC) za pomocą ręcznego licznika. Jeśli ponad 500 pasożytów zostało zliczonych przed osiągnięciem 200 WBC, liczenie zostanie zatrzymane po zakończeniu pola. Gęstość, wyrażona jako liczba pasożytów bezpłciowych na µl krwi, zostanie obliczona poprzez podzielenie liczby pasożytów bezpłciowych przez liczbę zliczonych WBC i skorygowanych o szacunkową gęstość WBC (zwykle 8000 na µl). Gdy liczba pasożytów bezpłciowych jest mniejsza niż 10 na 200 białych krwinek w kolejnych rozmazach, liczenie zostanie przeprowadzone na podstawie co najmniej 500 białych krwinek. Preparat krwi zostanie uznany za ujemny, gdy badanie 1000 białych krwinek nie wykaże obecności pasożytów bezpłciowych. Gęstość gametocytów zostanie obliczona poprzez zliczenie liczby gametocytów przypadających na 500 białych krwinek.

Stężenie hemoglobiny (Hb) będzie mierzone w pełnej krwi pobranej do mikrokuwety przy użyciu Hemocue zgodnie z instrukcjami producenta.

Wykrywanie molekularne P. falciparum: DNA zostanie wyekstrahowane z próbek krwi pobranych z palca pobranych do mikrotainerów. Potwierdzenie molekularne gatunków Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale i P.malariae) w dniu 0 zostanie przeprowadzone przez qPCR ukierunkowany na gen rybosomalny 18S. Ta sama metoda qPCR zostanie wykorzystana do identyfikacji i ilościowego określenia infekcji P. falciparum w dniu 0 i dalszych próbek.

Genotypowanie P. falciparum pod kątem nawrotu/nowej infekcji: genotypowanie nawracających infekcji zostanie przeprowadzone przez scharakteryzowanie jednokopiowych genów MSP1, MSP2 i GLURP w genomie Plasmodium falciparum, jak opisano w innym miejscu.

Ekstrakcja RNA i RT-qPCR dla gametocytów: RNA zostanie wyekstrahowane z próbek RNAprotect przy użyciu kolumn powinowactwa i trawienia genomowego DNA DNAzą. Aby wykryć i określić ilościowo etapy gametocytów P. falciparum, w dniu 0 i we wszystkich próbkach kontrolnych zostanie przeprowadzona qPCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) ukierunkowana na transkrypty genu Pfs25, zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami z modyfikacjami.

Testy wrażliwości na leki ex vivo: krew żylna pobrana do probówek EDTA/ACD (w dniu 0 i dniu nawrotu) zostanie przetworzona w ciągu 6 godzin po pobraniu. Krew zostanie odwirowana, a osocze i kożuszek leukocytarny usunięte i przechowywane w temperaturze -20ºC. Czerwone krwinki zostaną dwukrotnie przemyte w RPMI i ponownie zawieszone w pożywce hodowlanej (pożywka płynna RPMI 1640 LPLF) do 50% hematokrytu mieszaniny pożywki z krwią (BMM).

Standardowy test wrażliwości na lek ex vivo: ocena będzie zgodna z wytycznymi WHO „Zastosowanie terenowe testu in vitro do wrażliwości pasożytów ludzkiej malarii na leki przeciwmalaryczne” do oceny odpowiedzi P. falciparum na artemizyny.

Testy przeżycia w fazie pierścieniowej ex vivo (RSA) Oprócz standardowych testów ex vivo, zgodnie z opublikowanym protokołem, zbadana zostanie wydajność testów przeżycia w fazie pierścieniowej (RSA).

Molekularne markery oporności na artemizynę: wyekstrahowany DNA zostanie wykorzystany do genotypowania mutacji punktowych w domenie śmigła Kelcha (K13) P. falciparum, które zostały niedawno zidentyfikowane jako potencjalne markery molekularne oporności na artemizynę. Pokrótce, K13 będzie amplifikowany w zagnieżdżonej PCR przy użyciu starterów opisanych w procedurze WWARN INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Po potwierdzeniu elektroforezy w żelu agarozowym produkty zostaną zsekwencjonowane i przeanalizowane w celu identyfikacji polimorfizmów. Można również zbadać alternatywnych przyszłych kandydatów do oporności na artemizynę. 4. ZAPEWNIANIE JAKOŚCI Wizyty monitorujące miejsce będą zaplanowane w regularnych odstępach czasu. W trakcie tych wizyt weryfikowane będą informacje zapisane w kartotekach przypadków (CRF) z dokumentami źródłowymi (np. dokumentacją laboratoryjną i rejestrami klinik). Po zestawieniu formularzy CRF pod koniec okresu próbnego zostaną one sprawdzone pod kątem kompletności i dokładności. Dane będą dwukrotnie wprowadzane na miejscu do elektronicznej bazy danych (Epi Info), w której stosowane są specjalnie zaprojektowane kontrole komputerowe w celu wykrycia rozbieżności we wprowadzanych danych, nieprawidłowych zakresów danych i ogólnej spójności. Wszelkie rozbieżności zostaną rozwiązane poprzez odniesienie do oryginalnych sprawdzonych formularzy zbierania danych.

Wszystkie rozmazy krwi przy przyjęciu zostaną odczytane w miejscu badania, jak również przez starszego mikroskopistę w ośrodku koordynującym. Ponadto w ITM zostanie przeprowadzona zewnętrzna kontrola jakości na 10% losowo wybranych slajdów. Dla każdego z testów molekularnych (qPCR, RT-qPCR i genotypowanie pasożytów) 10% próbek przetwarzanych w NIMPE zostanie losowo wybranych do ponownej analizy w ITM. Zewnętrzna kontrola jakości wyników testów na obecność narkotyków ex vivo zostanie przeprowadzona w ITM, gdzie preparaty zostaną ponownie zbadane pod kątem 10% losowo wybranych izolatów.

5. Plan analizy statystycznej Czas usunięcia pasożyta jest zdefiniowany jako czas, który upłynął (w godzinach) od czasu leczenia pacjenta (pierwsza dawka) do pierwszego z dwóch kolejnych ujemnych preparatów krwi. Czas i tempo usuwania pasożytów, a także faza opóźnienia zostaną dopasowane za pomocą internetowego narzędzia PCE opracowanego przez WWARN. Analiza wskaźnika wyleczenia po 42 dniach zostanie przeprowadzona zarówno dla zmodyfikowanej populacji pacjentów z zamiarem leczenia (mITT) (wszyscy pacjenci zrandomizowani), jak i populacji pacjentów podlegających ocenie (zgodnie z protokołem). Pacjenci są kwalifikowani do analizy wskaźnika wyleczeń po 28/42 dniach, jeśli liczba pasożytów jest rejestrowana do dnia 26/40 lub pacjent przerywa leczenie z powodu „niezadowalającego efektu terapeutycznego” z powodu ponownego pojawienia się pasożytów. Analiza mITT obejmuje również pacjentów, którzy przerwali leczenie przed dniem 28/42 z przyczyn innych niż „niezadowalający efekt terapeutyczny” (np. może to obejmować „doświadczenia niepożądane” z powodu powtarzających się wymiotów). Tacy pacjenci będą liczeni w analizie mITT jako niepowodzenie leczenia, niezależnie od przyczyny przerwania leczenia. Pacjenci, którzy otrzymywali jednoczesne leczenie antybiotykami o działaniu przeciwmalarycznym, zostaną wykluczeni z pacjentów podlegających ocenie i włączeni do mITT.

Dla zmiennych kategorialnych procenty i odpowiadające im 95% przedziały ufności zostaną obliczone metodą Wilsona. Proporcje zostaną porównane poprzez obliczenie *2 z poprawką Yatesa lub dokładnym testem Fishera, gdzie to właściwe. Dane ciągłe o rozkładzie normalnym zostaną podsumowane jako średnie i odchylenia standardowe i porównane za pomocą testu t-Studenta i analizy wariancji. Dane niezgodne z rozkładem normalnym zostaną podsumowane jako mediany (IQR) lub średnie geometryczne i porównane za pomocą testu U Manna-Whitneya lub analizy wariancji Kruskala-Wallisa. Związek między 2 zmiennymi ciągłymi zostanie oceniony za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana.

Ryzyko niepowodzenia leczenia do 28. i 42. dnia zostanie ocenione za pomocą analizy przeżycia ze skumulowaną częstością występowania obliczoną metodą Kaplana-Meiera i porównaną za pomocą testu logarytmicznego Rank Mantela-Haenszela.

Metoda Kaplana-Meiera będzie również oceniać czasy klirensu pasożytów, gorączki i gametocytów.

Zmiany hematologiczne podczas pierwszego tygodnia leczenia, jak również powrót do zdrowia podczas cotygodniowej obserwacji zostaną ocenione poprzez pomiar zmian stężenia Hb między odpowiednio dniem 0, 3, 7 oraz dniem 14, 28 i 42.

6. KWESTIE ETYCZNE Zezwolenia etyczne Zezwolenia etyczne na przeprowadzenie badania uzyskano od Komisji Etyki Narodowego Instytutu Malariologii, Parazytologii i Entomologii w Hanoi oraz Uniwersytetu w Antwerpii, a także od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej przy ITM , Antwerpia.

Świadoma zgoda Pacjenci zostaną włączeni do badania tylko wtedy, gdy oni (lub rodzice lub opiekunowie dzieci) wyrażą świadomą zgodę. Prośba o zgodę jest dostępna w języku angielskim i przetłumaczona na język wietnamski i zostanie przeczytana w całości pacjentowi, rodzicowi lub opiekunowi. Zostaną wyjaśnione szczegóły dotyczące badania oraz jego korzyści i potencjalnego ryzyka. Po udzieleniu odpowiedzi na wszelkie pytania, dokument zostanie poproszony o podpis. Jeśli pacjent jest analfabetą, świadek musi podpisać pismo; jeśli to możliwe, sygnatariusz zostanie wybrany przez uczestnika i nie będzie miał powiązań z zespołem badawczym.